表沒食子兒茶素沒食子酸酯對3T3-L1細胞增殖、分化及血管生成的影響.pdf

1、背景：
　　肥胖是一種復雜的多因素的慢性疾病，是糖尿病、高血壓、腫瘤和心血管疾病的危險因素，肥胖及其相關慢性病的防治是營養(yǎng)與健康研究與實踐工作的重點。肥胖的發(fā)展是以脂肪細胞數量增加和細胞體積肥大所導致的脂肪積聚為特征。目前認為，脂肪組織的增生需要建立新生血管提供足夠的氧氣和營養(yǎng)，阻斷脂肪組織的血管生成可能是一個抑制脂肪生成的新途徑。脂肪組織是人體內最大的內分泌組織之一，可產生多種脂肪因子調節(jié)其自身及機體代謝，其中，它所分泌的血管內

2、皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）被認為是促進脂肪組織血管新生最重要的調節(jié)因子。最新研究證據表明，調節(jié)血管生成的藥物能通過調節(jié)脂肪組織脈管系統(tǒng)的生長和重構來影響脂肪的擴張和代謝。因此，針對脂肪組織的血管生成調節(jié)劑為肥胖癥的治療提供了一種新的治療選擇。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶中最豐富且最具有活性的成分，

3、已有研究證實其對肥胖有防治作用。幾項腫瘤新生血管抑制實驗表明，EGCG具有抑制腫瘤新生血管形成的作用。那么，EGCG是否具有抑制脂肪組織血管生成的潛力？目前尚無研究報道。我們假設EGCG可以通過抑制脂肪組織血管新生途徑調節(jié)脂肪組織生成及其功能。本課題在培養(yǎng)的脂肪細胞水平擬對上述假設進行驗證。
　　目的：
　　1．通過觀察EGCG對3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的影響，了解EGCG對脂肪組織生成的影響；
　　2．通過觀

4、察EGCG在3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化過程對VEGF表達的影響，以及脂肪細胞分泌的VEGF對人臍靜脈內皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）增殖及小管形成的影響，了解EGCG對血管生成的作用；
　　3．通過觀察EGCG對脂肪細胞轉錄因子PPARγ、C/EBPα對VEGF表達的作用，初步探索EGCG調控脂肪組織血管生成的分子機制。
　　方法：
　　1．采用x

5、CELLigence實時細胞分析系統(tǒng)觀察不同濃度的EGCG對3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞增殖的影響；
　　2．采用油紅O染色法檢測不同濃度的EGCG對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響；
　　3．采用ELISA法檢測不同濃度的EGCG處理的3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞細胞培養(yǎng)上清液中VEGF的含量；采用免疫熒光技術檢測不同濃度的EGCG對3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞VEGF表達的影響；采用實時熒光定量PCR技術檢測

6、不同濃度的EGCG對3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞VEGF表達的影響；
　　4．采用蛋白免疫印跡反應（Western Blotting）法和實時熒光定量PCR技術檢測不同濃度的EGCG對3T3-L1脂肪細胞PPARγ、C/EBPα的蛋白表達水平和mRNA水平的影響；
　　5．建立3T3-L1細胞和HUVEC的共培養(yǎng)體系，采用xCELLigence實時細胞分析系統(tǒng)觀察3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞對HUVEC增殖的影響；收

7、集采用EGCG和未采用EGCG處理的3T3-L1脂肪細胞的細胞培養(yǎng)上清液，用于培養(yǎng)接種于Matrigel膠上的HUVEC，觀察其對HUVEC小管生成的影響。
　　結果：
　　1．與對照組相比，0.5μg/ml~50μg/ml EGCG刺激均對3T3-L1前脂肪細胞的增殖顯著的抑制作用（P<0.05），且該作用呈現一定的劑量依賴關系。
　　2．雖然≤10μg/ml的EGCG刺激對3T3-L1前脂肪細胞的分化沒有明顯的影響

8、，但是高達25μg/ml的EGCG刺激能抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化（P<0.05）。
　　3．5μg/ml~50μg/ml EGCG刺激能抑制3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞的細胞上清液中VEGF分泌。免疫熒光實驗結果顯示，VEGF在3T3-L1脂肪細胞中的表達比與3T3-L1前脂肪細胞更多。實時熒光定量PCR結果顯示，EGCG能顯著降低3T3-L1前脂肪細胞和脂肪細胞中VEGF的表達。
　　4．Western Blo

9、tting和實時熒光定量PCR結果顯示，EGCG能顯著降低3T3-L1脂肪細胞PPARγ、C/EBPα的蛋白表達和mRNA表達。
　　5．3T3-L1細胞能刺激HUVEC的增殖，25μg/ml的EGCG處理的3T3-L1脂肪細胞的細胞上清液能夠抑制HUVEC小管生成。
　　結論：
　　首先，EGCG具有抑制前脂肪細胞和脂肪細胞的增殖，減少前脂肪細胞的分化，并降低脂質在脂肪細胞中積累的能力。其次，在細胞水平，我們發(fā)現EG