Treg在CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、B3型柯薩奇病毒(CVB3)是一種典型的腸道病毒，感染人體導(dǎo)致機(jī)體一系列急性或慢性疾病，如心肌炎、腦膜炎、胰腺炎等。病毒性心肌炎的慢性化過程伴隨著心肌纖維化，常與炎癥并存于病變心肌部位。研究已證實(shí)在CVB3誘導(dǎo)的心肌炎小鼠模型中炎癥細(xì)胞與心室的纖維化相關(guān)，其通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子或生長因子等形成炎癥微環(huán)境使成纖維細(xì)胞異常分泌ECM。心肌纖維化可導(dǎo)致心肌壁增厚、心臟擴(kuò)張、心肌功能逐步喪失，已成為影響人類健康的重大衛(wèi)生問題，但是迄今還沒

2、有有效防治心肌纖維化的措施。
　　心肌纖維化是指心臟組織中異?；罨男募〕衫w維細(xì)胞，過量分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），導(dǎo)致基質(zhì)蛋白在心肌層大量積累的一種在多種心血管疾病中普遍存在的病理變化，與心律失常、心功能障礙甚至心肌性猝死密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)纖維化的發(fā)生，并提出炎癥細(xì)胞與心室纖維化相關(guān)。近期研究發(fā)現(xiàn)不同T細(xì)胞亞群在小鼠心室重構(gòu)中發(fā)揮不同作用。炎癥條件下，Th1應(yīng)答具抗纖

3、維化作用，然而Th2卻會促進(jìn)纖維化。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一群具有免疫抑制作用的CD4+T細(xì)胞亞群，其在維持免疫耐受以及調(diào)節(jié)抗病毒免疫應(yīng)答中扮演了重要的角色。但是Treg在CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化中作用及作用機(jī)制仍不是很清楚。
　　為了闡明Treg在小鼠病毒性心肌炎纖維化過程中的作用及其可能免疫機(jī)制，在本研究中，我們利用CVB3感染雄性BALB/c小鼠誘導(dǎo)心肌纖維化模型，觀察了CVB3感染過程中心肌炎纖維化發(fā)生的過程，并檢測了

4、其中Treg的動(dòng)態(tài)改變。隨后，通過體內(nèi)清除和體內(nèi)輸注Treg，進(jìn)一步闡明了Treg對于病毒性心肌炎纖維化發(fā)生的作用;最后，通過體內(nèi)外試驗(yàn)，初步闡述了Treg參與病毒性心肌炎纖維化的作用的分子免疫學(xué)機(jī)制。
　　第一部分 CVB3感染誘導(dǎo)心肌纖維化小鼠模型的建立
　　以10 TCID50 CVB3感染BALB/c雄性小鼠，用real time-PCR檢測了與膠原蛋白合成相關(guān)的Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)，與膠原蛋白降解相

5、關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-1、MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1 (TIMP-1)mRNA的表達(dá)變化;以天狼猩紅染色檢測心肌層膠原纖維的沉積情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨CVB3感染時(shí)間的延長，小鼠心臟局部collagen Ⅰ mRNA水平顯著增高;MMP-1和MMP-3 mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)，相對于對照組，TIMP-1 mRNA的表達(dá)量在1到4周均上調(diào)，TIMP-1/MMP-1和TIMP-1/MMP-3的比值均明顯增高。同時(shí)病理

6、顯示:感染小鼠的心肌層積累了大量的膠原纖維。以上數(shù)據(jù)表明，我們用10 TCID50 CVB3感染雄性BALB/c小鼠，成功建立了病毒性心肌纖維化模型。
　　第二部分 Treg在CVB3誘導(dǎo)心肌纖維化發(fā)生中的作用
　　一、Treg與CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化呈負(fù)相關(guān)
　　為了研究Treg是否在心肌纖維化過程中發(fā)揮作用，我們首先以流式細(xì)胞術(shù)檢測了CVB3感染后小鼠體內(nèi)Treg的變化。結(jié)果表明，CVB3感染后第1周外周血和心臟

7、組織中分別含有0.22％和1％ Treg，之后其比例逐步下降。提示在心肌纖維化越來越嚴(yán)重的階段（2-4周），Treg的比例逐步減少。為明確Treg與心肌纖維化的相關(guān)性，在CVB3感染小鼠4周時(shí)，檢測了每一只小鼠外周血中Treg的比例以及膠原蛋白mRNA的表達(dá)水平和小鼠心臟中膠原纖維的沉積程度。結(jié)果表明，小鼠外周血Treg越少，其膠原蛋白mRNA表達(dá)量越多，而且心臟中膠原沉積的程度越嚴(yán)重。以上數(shù)據(jù)證明Treg與心肌纖維化呈負(fù)相關(guān)，并初步提

8、示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有抑制纖維化的作用。
　　二、去除Treg可加劇CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　為了進(jìn)一步證明Treg具有抑制纖維化作用，以anti-CD25單克隆抗體腹腔注射小鼠去除CVB3感染小鼠中的Treg，觀察心肌纖維化的情況。發(fā)現(xiàn)，相對于對照組（Isotype+CVB3組），anti-CD25注射組小鼠心臟局部collagen Ⅰ表達(dá)顯著上調(diào)，TIMP-1、TIMP-1/MMP-1以及TIMP-1/MMP-3表達(dá)上調(diào)

9、，提示膠原蛋白合成增加而降解減少。天狼猩紅染色與上述結(jié)果一致，在體內(nèi)去除Treg的小鼠心肌層中，沉積了更多的膠原纖維。以上實(shí)驗(yàn)提示，在CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化模型中，去除Treg可加劇心肌纖維化程度。
　　三、輸注Treg可緩解CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化
　　以上結(jié)果提示小鼠Treg不足時(shí)，CVB3感染后會導(dǎo)致更為嚴(yán)重的心肌纖維化。我們推測增加小鼠體內(nèi)的Treg的數(shù)量，可緩解CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化。 為驗(yàn)證這一推論，從感染的

10、小鼠脾臟中分離得到Treg并將其回輸至小鼠體內(nèi)，并用CVB3感染小鼠。發(fā)現(xiàn):較只感染了CVB3的小鼠，輸注Treg的小鼠心肌層中膠原沉積大幅減少，心臟局部collagen Ⅰ、TIMP-1、TIMP-1/MMP-1和TMP-1/MMP-3的變化同樣有利于心肌纖維化得到改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，體內(nèi)增加Treg數(shù)量有利于緩解CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化。
　　綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Treg能夠顯著抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化，干預(yù)小鼠體內(nèi)的T

11、reg數(shù)量，可顯著改變心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分 Treg抑制CVB3誘導(dǎo)心肌纖維化的分子機(jī)制
　　一、Treg抑制心肌纖維化作用的細(xì)胞非接觸途徑可能通過TGFβ和IL-10介導(dǎo)
　　已知Treg通過細(xì)胞接觸和細(xì)胞非接觸機(jī)制（分泌抑制性細(xì)胞因子）發(fā)揮抑制功能，為研究Treg抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化的作用機(jī)制，我們在回輸Treg的同時(shí)分別給予小鼠抗TGFβ或抗IL-10的中和抗體。發(fā)現(xiàn)，相較于輸注Treg小

12、鼠，TGFβ抗體組和IL-10抗體組的小鼠心肌層均發(fā)現(xiàn)更多的膠原纖維沉積。以上結(jié)果初步提示，TGFβ和IL-10在Treg介導(dǎo)的減弱心肌纖維化的過程中均發(fā)揮重要作用。
　　為了進(jìn)一步證實(shí)TGFβ和IL-10在抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化中的作用，我們用anti-CD25去除小鼠體內(nèi)Treg，同時(shí)分別注射細(xì)胞因子TGFβ或IL-10。結(jié)果顯示，去除了Treg的小鼠心肌纖維化顯著加重，而在此基礎(chǔ)上補(bǔ)充細(xì)胞因子TGFβ和IL-10可一定

13、程度上減輕心肌纖維化，但仍然要比未去除Treg組的感染小鼠的心肌纖維化嚴(yán)重。以上數(shù)據(jù)表明，Treg改善CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化部分依賴于細(xì)胞因子TGFβ和IL-10，同時(shí)也提示，Treg可能還通過其他途徑如細(xì)胞接觸機(jī)制抑制心肌纖維化的發(fā)生。
　　二、Treg抑制心肌纖維化作用存在細(xì)胞接觸和非接觸途徑
　　體內(nèi)試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Treg可通過分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抑制心肌纖維化的作用，我們通過體外試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Treg抑制成纖維細(xì)胞的作用

14、機(jī)制。從感染了CVB3的小鼠心臟中分離得到心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast，CF)和Treg，二者以不同比例(CF∶ Treg;1∶1，1∶2.5，1∶5)共培養(yǎng)，檢測其Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Treg能夠減少成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白collagen Ⅰ的合成，同時(shí)降低TI

15、MP-1的表達(dá)，并且呈劑量依賴。為 闡明體外Treg抑制心肌成纖維細(xì)胞的分子機(jī)制，采用transwell培養(yǎng)體系共培養(yǎng)成纖維細(xì)胞和Treg，發(fā)現(xiàn):相較于接觸培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞collagen Ⅰ的表達(dá)量，非接觸培養(yǎng)體系中成纖維細(xì)胞的collagen Ⅰ的表達(dá)量增多，說明Treg能夠通過分細(xì)胞接觸抑制的途徑抑制成纖維細(xì)胞;相對于對照組(不加Treg)，非接觸Treg共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的collagen Ⅰ下調(diào)表達(dá)，說明Treg能夠通過分

16、泌細(xì)胞因子抑制成纖維細(xì)胞。提示:Treg與成纖維細(xì)胞之間的相互作用部分依賴細(xì)胞接觸，部分依賴分泌細(xì)胞因子。接下來，向非接觸的共培養(yǎng)體系中分別添加不同濃度的抗TGFβ和抗IL-10的抗體，發(fā)現(xiàn)IL-10抗體能夠有效地降低Treg對心肌成纖維細(xì)胞的抑制功能。體外實(shí)驗(yàn)提示，Treg主要通過細(xì)胞接觸和分泌細(xì)胞因子(IL-10)的途徑發(fā)揮對心肌成纖維細(xì)胞的抑制作用。
　　綜上所述，我們闡明了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可通過細(xì)胞接觸依賴和細(xì)胞非接觸依賴的途

17、徑抑制CVB3誘導(dǎo)的心肌纖維化。在CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌纖維化過程中，Treg比例與心肌纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)清除Treg可加劇心肌纖維化，而輸注Treg則可緩解心肌纖維化程度，提示Treg具有顯著抑制心肌纖維化的作用。進(jìn)一步體內(nèi)外中和試驗(yàn)提示:Treg抑制心肌纖維化的作用部分依賴于Treg分泌的細(xì)胞因子，部分依賴于Treg膜表面的抑制性分子，具體機(jī)制還需深入研究。本研究以Treg為切入點(diǎn)，深入研究其在CVB3病毒性心肌炎纖維化中的