PDGFs-PDGFRs信號通路在去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的作用及其可能的機制研究.pdf

1、研究背景和目的:心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)是心肌間質(zhì)中類成纖維細胞過量增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)沉積與降解失衡的病理過程,是多種心血管疾病的終末病理表現(xiàn)。型和Ⅲ型膠原蛋白是導(dǎo)致MF的主要膠原蛋白類型。心肌纖維化一方面可致心室壁僵硬度增加、舒張順應(yīng)性下降,早期出現(xiàn)舒張期充盈受限,晚期導(dǎo)致心肌收縮功能損害,促發(fā)心力衰竭;另一方面由于纖維化心肌組織的電傳導(dǎo)異常,?？蓪?dǎo)致多種惡性心律失常的發(fā)生,甚至是猝死。目前認

2、為,心肌纖維化與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)、成纖維細胞、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和生長因子等有關(guān),是各種刺激誘導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)的最終結(jié)局。目前已經(jīng)得到公認的是心肌纖維化發(fā)生與體內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)作用密切相關(guān),血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)和AngⅡ受體抑制劑(ARB)類藥物臨床應(yīng)用的相關(guān)研究結(jié)果顯示兩者均具有一定減輕或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化、心室重塑及改善心血管疾病預(yù)后的作用,反映出RAAS在MF發(fā)生、發(fā)展過

3、程中的重要作用地位。近年來作為RAAS下游組成部分的醛固酮(Aldosterone;ALD)和去氧皮質(zhì)酮(Deoxycorticosterone;DOCA)所代表的鹽皮質(zhì)激素導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生的觀點得到更多研究證實,但其具體作用的分子機制仍不清楚,相關(guān)研究已成為心肌纖維化防治領(lǐng)域的熱點。
　　既往在去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化模型中進行的研究表明,鹽皮質(zhì)激素增多能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生心肌纖維化,而且發(fā)現(xiàn)DOCA/salt誘導(dǎo)

4、的大鼠心肌纖維化中PDGFs/PDGFRs信號通路參與了心肌纖維化的形成,觀察到心肌組織炎癥反應(yīng)增加的現(xiàn)象。抑制單核/巨噬細胞的浸潤可以減少心肌纖維化,表明炎癥反應(yīng)在心肌纖維化中發(fā)揮作用。然而心肌組織的炎癥反應(yīng)是否與PDGFs/PDGFRs信號通路有關(guān),尚沒有相關(guān)文獻報道。此外,PDGFs/PDGFRs信號通路通過何種途徑參與心肌纖維化進程目前尚不清楚。已有研究顯示,心臟成纖維細胞有潛在分化成肌成纖維細胞的作用,且在心肌梗死后心肌纖維化

5、的研究中推測PDGFs/PDGFRs信號通路調(diào)節(jié)心肌纖維化進程很可能是通過直接刺激成纖維細胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞,大量合成膠原蛋白的結(jié)果。但體內(nèi)研究尚未得到證實。
　　本研究通過建立去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化模型,觀察心肌組織的單核/巨噬細胞浸潤、PDGFs及其受體PDGFRs表達情況、PDGFRs細胞表達類型以及心臟成纖維細胞和肌成纖維細胞的數(shù)量變化,并進一步分別采用法舒地爾和伊馬替尼進行干預(yù)性治療,探討醋

6、酸去氧皮質(zhì)酮(DOCA)誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化中炎癥反應(yīng)增加是否能夠過度激活血小板源性生長因子(PDGFs)信號通路和PDGFs/PDGFRs信號通路在去氧皮質(zhì)酮(DOCA)誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化的作用及其對心臟成纖維細胞和肌成纖維細胞的影響。
　　實驗方法:1.實驗動物分組:實驗開始階段給予大鼠10％水合氯醛(400 mg·kg-1)腹腔麻醉,行右腎切除術(shù),術(shù)后1周開始給予1%氯化鈉及0.2%氯化鉀飲水,

7、隨機分為4組,每組10或20只:(1)對照組(CON組):注射用大豆油4天一次皮下注射及蒸餾水每天灌胃一次;(2)去氧皮質(zhì)酮組(DOCA組):去氧皮質(zhì)酮60 mg·kg-1·4d-1皮下注射及蒸餾水每天灌胃一次;(3)去氧皮質(zhì)酮+伊馬替尼組(DOCA+IMA組):去氧皮質(zhì)酮60 mg·kg-1·4d-1皮下注射,同時給予伊馬替尼60 mg·kg-1·d-1灌胃,每天一次;(4)去氧皮質(zhì)酮+法舒地爾組(DOCA+FAS組):去氧皮質(zhì)酮60

8、 mg·kg-1·4d-1皮下注射,同時給予法舒地爾10 mg·kg-1·d-1灌胃,每天兩次。其中CON組灌胃用蒸餾水體積與另兩組灌胃藥物所溶蒸餾水體積相同,CON組皮下注射大豆油體積與另兩組皮下注射藥物所溶大豆油體積相同。
　　2.血壓測定:使用尾套法測定大鼠動脈收縮壓(SBP),分別于干預(yù)前、干預(yù)第14天及第28天尾套法測定各組大鼠收縮壓。3.蘇木精-伊紅(HE)染色觀察心肌組織炎癥反應(yīng)情況。4.苦味酸-天狼猩紅染色觀察大鼠

9、心肌間質(zhì)纖維化程度和心肌血管周圍膠原面積(PVCA)/血管腔面積(VA)比值。5.實時熒光定量 PCR法檢測心肌組織成纖維細胞特異蛋白-1（FSP-1,S100A4)、α-平滑肌動蛋白(α-SMA)、前膠原蛋白Ⅰ(procollagenⅠ)、前膠原蛋白Ⅲ(procollagenⅢ)、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PDGFRα及PDGFRβ的mRNA含量。6.免疫組化法觀察心肌組織單核巨噬細胞抗原(ED-1)、心

10、肌組織波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌動蛋白(α-SMA)以及血小板源性生長因子受體(PDGFRα、PDGFRβ)及磷酸化的PDGFRβ(p-PDGFRβ)蛋白表達。7.免疫熒光法定位PDGFRα、PDGFRβ表達的細胞類型。
　　實驗結(jié)果:(1)干預(yù)第14天DOCA組和DOCA+FAS組大鼠SBP顯著升高,兩組相比無明顯差異(P>0.05),但均顯著高于 CON組(P<0.01)。干預(yù)第14天和第28天血壓測定結(jié)果顯示

11、DOCA及 DOCA+IMA組大鼠 SBP均明顯高于 CON組(P<0.01),而DOCA組與DOCA+IMA組SBP無差異(P>0.05)。(2)干預(yù)第14天DOCA組炎癥反應(yīng)、ED-1較CON組明顯增加,PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGFRα、PDGFRβmRNA的表達不同程度增加,PDGFRα、PDGFRβ蛋白表達也增加(P<0.01),而PDGF-D mRNA表達未增加,使用具有抗炎作用的法舒地爾后,DOCA+F

12、AS組炎癥反應(yīng)較DOCA組明顯減少,PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGFRαmRNA的表達、PDGFRα蛋白表達減少,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),但PDGFRβmRNA和蛋白表達未見明顯降低(P>0.05)。(3)干預(yù)第28天DOCA組心肌間質(zhì)纖維化程度和PVCA/VA比值明顯高于CON組(P<0.01),DOCA+IMA組心肌間質(zhì)纖維化程度和PVCA/VA比值雖高于CON組(P<0.05),但較DOCA組顯著減小(P<

13、0.01)。(4)干預(yù)第14天DOCA組較CON組PDGFRα、PDGFRβmRNA表達增加(P<0.01),DOCA+IMA組較 DOCA組 PDGFRα、PDGFRβ mRNA表達減少(P<0.01)。干預(yù)第28天與CON組相比,DOCA組PDGFRβ、FSP-1、α-SMA、procollagenⅠ、procollagenⅢmRNA表達明顯增加(P<0.01),而PDGFRαmRNA表達未見明顯增加,組內(nèi)比較顯示PDGFRβ mR

14、NA表達大于PDGFRα,DOCA+IMA組較DOCA組PDGFRβ、FSP-1、α-SMA、procollagenⅠ、procollagenⅢmRNA表達減少(P<0.01)。(5)干預(yù)第14天與CON組相比,DOCA組PDGFRα、PDGFRβ蛋白表達增加(P<0.01),DOCA+IMA組較DOCA組PDGFRα蛋白表達減少(P<0.01)。干預(yù)第28天與CON組相比,DOCA組PDGFRβ、p-PDGFRβ蛋白表達明顯增加(P<

15、0.01),而PDGFRα蛋白表達量未見明顯增加(P>0.05),DOCA+IMA組較DOCA組 PDGFRβ、p-PDGFRβ蛋白表達減少(P<0.01)。干預(yù)第28天,CON組大鼠心臟間質(zhì)主要是vimentin陽性的成纖維細胞,α-SMA表達的很少,DOCA組大鼠α-SMA陽性的梭形細胞(顯然是肌成纖維細胞)數(shù)量明顯增加(P<0.01),DOCA+IMA組較DOCA組肌成纖維細胞數(shù)量均減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.PD

16、GFRα主要在心肌纖維化早期發(fā)揮作用,PDGFRβ在全程均起作用,而且對血管纖維化也有作用。
　　2.PDGFRα和PDGFRβ表達主要位于心肌成纖維細胞和肌成纖維細胞中。
　　3.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌成纖維細胞的大量增殖,肌成纖維細胞亦明顯增加。
　　4.單核巨噬細胞、成纖維細胞和肌成纖維細胞在DOCA誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化中起著關(guān)鍵作用。
　　5.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化模型中

17、,大量膠原蛋白沉積于心肌間質(zhì),應(yīng)用酪氨酸激酶受體抑制劑可抑制PDGFRs活性,減少成纖維細胞、肌成纖維細胞及膠原蛋白含量。
　　6.在動脈血壓無明顯差異的情況下,DOCA+IMA組大鼠心肌組織CVF及PVCA值較DOCA組均顯著減小,說明伊馬替尼可不依賴于降低血壓抑制心肌纖維化發(fā)生。
　　7.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌間質(zhì)有明顯的炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)和PDGFs/PDGFRα信號通路均參與其中,伴隨著炎癥反應(yīng)的減少,

18、PDGFs/PDGFRα信號通路的表達隨之減少,表明 PDGFs/PDGFRα信號通路的過度激活與心肌炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　8.DOCA誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化可能機制是DOCA刺激單核/巨噬細胞上的鹽皮質(zhì)激素受體(MR)過度激活致使單核/巨噬細胞浸潤,炎癥反應(yīng)增加,單核/巨噬細胞等炎癥細胞增殖、募集滲出并分泌大量PDGFs,同時成纖維細胞亦分泌PDGFs,激活并結(jié)合成纖維細胞上的PDGFRs,打開PDGFs/PDGFRs