應用原子力顯微鏡對甲狀腺相關眼病外周血T淋巴細胞膜表面超微結構的研究.pdf

1、目的：甲狀腺相關眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)屬器官特異性自身免疫性疾病，眼球突出是其主要的臨床體征，發(fā)病率居成年組眼眶病之首，約占20％。該病通常存在自限性，只有不足10％的患者會出現(xiàn)視力模糊、視神經障礙、角膜潰瘍、全眼球炎甚至失明等嚴重后果。國內外一致認為自身免疫性疾病是機體免疫系統(tǒng)針對自身抗原產生免疫應答，以致破壞自身正常組織結構并引起相應的臨床癥狀。TAO在環(huán)境、遺傳等背景存在

2、下，自身耐受遭到破壞，機體對自身抗原識別，產生了自身反應性T細胞，在多種細胞因子作用下，T細胞活化、遷移至眶后組織，引起特定組織損傷，導致疾病發(fā)生。臨床實踐中我們對TAO患者的T細胞活化狀態(tài)的準確評估是獲得較好療效的前提。對于活動期TAO患者多采用皮質類固醇和免疫抑制劑藥物聯(lián)合應用，輔以局部放療，小劑量化療；而對于靜止期的患者，藥物療效并不明顯，在壓迫性視神經病變引起視力急劇下降的情況下可采取提上瞼肌延長術及眶減壓術等手術治療方案。

3、 T細胞膜表面存在IL-2受體α鏈(CD25)，該CD分子的表達為T細胞激活的第一事件，在維持自身免疫耐受中發(fā)揮重要作用。本實驗應用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy，AFM)對TAO患者外周血T細胞的膜表面進行觀測，第一部分比較正常組與TAO患者T細胞之間的差異，探索可供研究的參數指標；第二部分進一步觀測靜脈注射激素治療TAO患者用藥前后，T細胞超微結構是否存在變化，這些改變是否能夠通過AFM所提供的參數

4、客觀的表現(xiàn)出來；第三部分初步探索T細胞表面的超微結構改變與CD25分子含量的相關性，探討AFM所觀測的指標是否可以作為反映細胞功能活化狀態(tài)的客觀依據，從而能夠反映TAO免疫活動程度。 方法：將研究對象分為三組：正常對照組(n=12例)、TAO活動期組(n=18例)和TAO靜止期組(n=22例)。 1、外周血單個核細胞的分離：取晨起空腹肝素抗凝外周血3ml，用PBS緩沖液稀釋到2倍體積，充分混勻后沿管壁緩慢地加入事先已裝有

5、3ml聚蔗糖--泛影葡胺淋巴細胞分離液的14ml一次性離心管內，水平式轉頭500xg離心20min，取懸浮于血漿與分層液的界面之間灰白層，移入另一離心管，用5倍以上PBS緩沖液充分洗滌，200xg離心10 min，2次。 2、Dynal免疫磁珠分離純化T細胞：將分離得到的單個核細胞沉淀放置于4℃下，加入一定量Dynabeads(72μlbeads/ml PBMC)再加入1 ml左右的PBS(2％FCS)重懸細胞：把裝有此混合液的

6、試管置于DynalMPC上2～3 min；棄去懸浮液，T細胞黏附在試管與DynalMPC接觸的一側；上述細胞懸浮液每100μl加入10μDETACHaBEAD，放置室溫孵育45～60min，不斷溫和混勻；再置于DynalMPC上2min；吸取懸浮液至新的試管中。 3、將獲得的T細胞一部分用于活性檢測和鑒定：臺盼藍排斥實驗檢測細胞活性；HE、免疫細胞化學染色鑒定T細胞，流式細胞分析技術檢測CD3+T細胞的純度。 4、細胞培

7、養(yǎng)：將試管中其余所有T細胞置于5％CO2的孵箱中，于37℃培養(yǎng)48h。 5、AFM樣品的制備和觀測：將培養(yǎng)細胞離心，用2.5％戊二醛溶液中固定30min，在三蒸水中浸泡過夜，載玻片置于超凈臺空間下自然晾干。AFM選擇Tapping模式，對每個細胞進行整體掃描，然后選擇最亮區(qū)域改變掃描范圍為1um，掃描速率為2Hz進行局部掃描。一個血樣制成一個樣本，每個樣本掃描10個細胞，每個細胞掃描20個區(qū)域，求平均數代表一個樣本的測量數，圖像

8、經儀器平滑處理。數據采集和分析。 6、應用上述方法對TAO活動期患者大劑量激素沖擊治療前后T細胞進行對比觀測。 7、應用流式細胞儀測得TAO外周血T細胞CD25分子表達百分含量，與AFM所測得的參數進行相關性分析。 結果：1、經常規(guī)分離、培養(yǎng)的正常組和TAO組兩個分期的T細胞在形狀上均呈現(xiàn)較為規(guī)則的圓形；正常組T細胞直徑約在5-8um，高度在600-850nm之間，表面總體較光滑但其超微結構也并非完全均一，而TA

9、O急性期T細胞直徑偏大，約在9-11um之間，表面的凹凸不平較明顯，出現(xiàn)明顯的顆粒狀突起及凹陷，邊緣還可觀察到有細微的樹枝狀突起分布；靜止期的T細胞直徑略小，約在8-10um之間，而膜表面的粗糙程度介于正常組和TAO急性期組之間。 2、應用單因素方差分析將三組T細胞的觀測參數進行統(tǒng)計分析得出結果：Ra、Peak count、Rpm、Rvm、Surface areadiff在α=0.05水平上，P<0.00，均存在統(tǒng)計學意義，有顯

10、著差異。 3、應用多個樣本間均數比較，Peak count，Surface areadiff在三組間均存在差異，即正常對照組、TAO活動期組和靜止期組兩兩之間存在差異。 4、經過大劑量沖擊治療后，T細胞的直徑變小，約為9-11um，表面的凹凸不平的程度也較治療前有所下降。對AFM測量的指標，進行配對t檢驗，Peak count、Rpm、Rvm、Surface area diff存在顯著性差異，表明活動期TAO患者激素治療

11、前后外周血T細胞膜表面存在超微結構的改變。 5、應用多元線性回歸以及曲線擬合方法，分析膜表面參數中Peak count、Rpm、Rvm、Surface area difr與T細胞膜表面CD25分子的相關性。 CD25與AFM所測參數Rvm、Surface area diff、Peakcount均存在相關性，運用逐步回歸分析Rvm(x2)、peakcount(x1)，建立回歸方程：Y=0.188x1+0.56X2-0.21

12、9，本實驗認為Rvm、peakcount可以作為衡量CD25表達含量多少的參考指標。 結論：1、正常對照組與TAO活動期和靜止期的T細胞在大小、膜表面超微結構均存在不同。經過多個樣本間均數比較，有一些指標在三組之間存在兩兩差異，而一些指標在TAO靜止期組和正常對照組之間并無差異，提示我們雖然靜止期TAO的T細胞活性不如活動期表現(xiàn)明顯，但是免疫系統(tǒng)仍處在某種不平衡的異常狀態(tài)，可能只是細胞免疫應答的功能有所減退。 2、使用激