阿魏酸鈉對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠骨橋蛋白和CD44表達(dá)的影響.pdf

1、目的：腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitinal fibrosis，RIF)是各種慢性腎損害的共同特征。與腎小球硬化相比，腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能損害的程度有更高的相關(guān)性，故常以間質(zhì)纖維化作為評(píng)價(jià)各種腎臟病進(jìn)展程度的可靠指標(biāo)。 腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制及因素較多，其中腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞的積聚程度與隨后相應(yīng)部位的纖維化程度密切相關(guān)，是啟動(dòng)腎間質(zhì)纖維化病變的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)。由于間質(zhì)的巨噬細(xì)胞來(lái)源于血液中的單核細(xì)胞，因此腎間質(zhì)產(chǎn)生

2、的趨化因子在該過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而骨橋蛋白(osteopontin OPN)是吸引腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞最重要的趨化因子，其表達(dá)量與間質(zhì)炎癥和纖維化程度密切相關(guān)。OPN不但趨化循環(huán)中的單核巨噬細(xì)胞到腎小管間質(zhì)，而且直接刺激腎固有細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞，啟動(dòng)或擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致腎小管變性損傷，繼而腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化、腎小管萎縮消失。研究發(fā)現(xiàn)在腎小管最初受損時(shí)，OPN還可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞再生和重建，幫助其功能的恢復(fù)，但隨著病情的發(fā)展

3、，病變逐漸嚴(yán)重，這種作用失代償。由此可推斷通過(guò)局部阻斷OPN因子，抑制單核巨噬細(xì)胞在腎間質(zhì)的聚集與增殖，可達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)，減輕腎小管損傷、抑制纖維化的目的。CD44是OPN的主要配體，已有的研究表明，CD44在炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 阿魏酸鈉(sodium ferulate，SF)是阿魏酸的合成鈉鹽，普遍存在于當(dāng)歸、川芎等常用植物藥中，水溶性好，已證實(shí)SF為一種非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，可清除自由基，防治脂質(zhì)過(guò)氧化損傷；拮抗內(nèi)

4、皮素引起的血管收縮、升壓、血管平滑肌細(xì)胞增殖，減輕血管內(nèi)皮損傷、增加一氧化氮(NO)合成、松馳血管平滑肌等特征，可以延緩腎間質(zhì)纖維化，發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用。目前尚未檢索到阿魏酸鈉在UUO模型中對(duì)于OPN及CD44調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典的UUO模型來(lái)進(jìn)行小管間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制及干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究，通過(guò)病理及免疫組化的方法觀測(cè)腎臟中OPN及CD44的表達(dá)情況，并觀察經(jīng)阿魏酸鈉干預(yù)后，OPN、CD44及單核巨噬細(xì)胞抗原陽(yáng)性(ED-1+)細(xì)胞表達(dá)

5、的改變情況，以闡明OPN參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展及阿魏酸鈉發(fā)揮腎臟保護(hù)作用機(jī)理之一是通過(guò)下調(diào)OPN和CD44的表達(dá)。 方法：選擇清潔級(jí)健康雄性SD大鼠54只，體重(210±10)克，隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(A組n=18)，輸尿管結(jié)扎組(B組n=18)，阿魏酸鈉治療組(C組n=18)。將各組大鼠以水合氯醛(0.1ml/kg)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上1/3處用4號(hào)線上下結(jié)扎兩處，然后從

6、中剪斷輸尿管，以防逆行性感染，A組除不結(jié)扎和剪斷輸尿管外，其他手術(shù)過(guò)程同前。術(shù)后各組大鼠均正常飲食。A組和B組大鼠用生理鹽水2ml灌胃，1次/日；C組大鼠以阿魏酸鈉混懸液110mg/kg/d灌胃，1次/日。三組均于術(shù)前一天開(kāi)始灌胃至術(shù)后第3、7、14d每組大鼠各取6只處死，快速取出左腎，按冠狀位縱形切開(kāi)，取腎組織的1/2置于10％福爾馬林固定液固定48小時(shí)，然后行石蠟包埋，制成5μm切片，分別用于光鏡、蘇木蘇伊紅染色(HE染色)、馬松染

7、色(Masson染色)觀察腎臟病理改變，采用免疫組織化學(xué)染色測(cè)定OPN、CD44的表達(dá)及腎間質(zhì)單核巨噬細(xì)胞數(shù)的變化，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：光鏡下觀察，HE及Masson染色A組未見(jiàn)異常，B組及C組各時(shí)相點(diǎn)大鼠腎臟腎小球無(wú)明顯變化。HE

8、染色B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張不明顯，間質(zhì)中少量單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)寬度增加；B組7天可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張明顯，上皮細(xì)胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見(jiàn)萎縮腎小管；B組14天上述病變加重，可見(jiàn)彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中大量淋巴單核細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化較明顯。Masson染色可見(jiàn)B組術(shù)后3天腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)寬度增加，膠原纖維增加，染色加深；此后，

9、病變逐漸加重。C組與B組平行相比腎小管間質(zhì)病變程度明顯減輕，腎間質(zhì)相對(duì)面積明顯減少(P<0.05)。三組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：①OPN在A組腎組織的亨利氏襻升支粗段、遠(yuǎn)曲小管、集合管均有少量持續(xù)表達(dá)，而在腎小球內(nèi)基本無(wú)表達(dá)。B組大鼠梗阻側(cè)腎小管-間質(zhì)中OPN表達(dá)較A組明顯增加(P<0.05)且表達(dá)隨小管損傷范圍的增加及腎間質(zhì)纖維化的加重呈明顯升高趨勢(shì)。OPN主要分布在腎小管上皮細(xì)胞胞漿及腎小管上皮刷

10、狀緣，部分間質(zhì)細(xì)胞亦有表達(dá)。術(shù)后3天，B組大鼠腎組織表達(dá)量較A組有增加，且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)升高程度更加明顯，至第14天表達(dá)最強(qiáng)。C組大鼠在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腎小管-間質(zhì)OPN表達(dá)均明顯低于B組，但仍高于A組(P<0.05、)。②CD44在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)。A組在整個(gè)過(guò)程中腎小管細(xì)胞只有低度表達(dá)。B組腎小管CD44表達(dá)第3d時(shí)開(kāi)始上升，第14d升至高峰。C組腎組織各時(shí)間點(diǎn)CD44表達(dá)量較B組明顯減輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。③腎間質(zhì)巨噬

11、細(xì)胞的浸潤(rùn)：A組各時(shí)期偶可見(jiàn)到巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。B組術(shù)后第3天可見(jiàn)少量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，第7天可見(jiàn)多量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，第14天最多，均高于A組(P<0.05)。C組與A組同時(shí)期相比巨噬細(xì)胞均升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。C組與B組同時(shí)相相比巨噬細(xì)胞數(shù)有明顯減少，二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。相關(guān)分析：本研究顯示，腎小管CD44和OPN的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與小管間質(zhì)內(nèi)ED-1浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)有明顯的相關(guān)關(guān)系，呈正相關(guān)。結(jié)論：隨單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠病情