人妊娠早期uNK細(xì)胞表面CD44及其配體骨橋蛋白在母胎界面表達研究.pdf

1、妊娠是一個非常復(fù)雜、變化極為協(xié)凋的生理過程。對母體而言，妊娠物相當(dāng)于半同種異體移植物。母胎之間存在著特殊的免疫平衡關(guān)系，使胚胎或胎兒不被攤斥。因而，母胎之間的免疫平衡足維持正常妊娠的基礎(chǔ)。 目前植入免疫學(xué)的研究熱點之一是子宮自然殺傷細(xì)胞(uterine nature killer cell，-uNK)的功能研究。對胚胎植入?yún)^(qū)的研究發(fā)現(xiàn)有大量的uNK細(xì)胞并與侵襲的絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞緊密接觸，該現(xiàn)象提示uNK細(xì)胞可能在調(diào)控母體對半同種異

2、體基因胚泡的容受性中起重要的作用。 uNK細(xì)胞是NK細(xì)胞系中功能獨特的亞群，uNK細(xì)胞表面表達一種重要的粘附因子-CD44分子，有關(guān)CD44分子在妊娠中的變化及其在母胎免疫平衡中的功能研究較少。CD44分子是粘附因子家族成員，它在淋巴細(xì)胞尤其是T、NK細(xì)胞的活化、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中起到重要作用。許多因素參與調(diào)控uNK細(xì)胞生長、發(fā)育及功能，如內(nèi)分泌激素、細(xì)胞因子及趨化因子等。骨橋蛋白(osteopontin,

3、OPN)是一種分泌型糖基化磷蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，分胞內(nèi)型和胞外型，胞內(nèi)型使細(xì)胞自身遷移活動加強，胞外型可作為趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，因此OPN參與細(xì)胞的黏附、遷移等多種細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)，是機體組織或器官發(fā)育過程中一個重要的調(diào)節(jié)因素，OPN足CD44的主要配體之一，可能參與了表達CD44的淋巴細(xì)胞的運動。表達CD44的蛻膜CD56brightCD16NK細(xì)胞為何能在子宮內(nèi)大量聚集，且保持其低殺傷活性等現(xiàn)象一直是人們關(guān)注的焦點。研

4、究蛻膜中uNK細(xì)胞聚集的機理有助于理解母胎免疫耐受，也將為病理性妊娠發(fā)病機制及防治的研究提供新的思路和途徑。 第一部分 人妊娠早期uNK細(xì)胞表面CD44及其配件OPN在母胎界面的表達 目的： 1.研究妊娠早期婦女CD56brightCD16-子宮NK細(xì)胞(uNK細(xì)胞)和CD56brightCD16-外周血NK細(xì)胞(pNK細(xì)胞)表面CD44的表達，探討CD56brightCD16-uNK細(xì)胞中CD44表達與

5、母胎界面免疫耐受形成的關(guān)系。 2.探討人妊娠早期母胎界面中滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜組織中OPN的表達及生物學(xué)意義 方法： 1.選擇20例孕5～9周非意愿正常妊娠婦女要求行人工流產(chǎn)者，采集其新鮮蛻膜和外周血；另外選擇20例正常非孕健康婦女采集其外周血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測蛻膜和外周血中CD56brightCDl6NK細(xì)胞的數(shù)量及CD44的表達。 2.選擇孕5～9周5例非意愿正常妊娠婦女要求行人工流產(chǎn)者，行人工流產(chǎn)術(shù)分

6、離其新鮮蛻膜組織、絨毛組織；Trizol法分別提取各組織中總RNA；采用RT-PCR技術(shù)及光密度半定量分析OPN在正常人類早期妊娠流產(chǎn)標(biāo)本中mRNA表達；免疫組化技術(shù)檢測OPN在正常人類早期妊娠流產(chǎn)標(biāo)本中蛋白水平的表達。 結(jié)果： 1.早期妊娠婦女子宮蛻膜淋巴細(xì)胞中CD56brightCD-16NK細(xì)胞約占70％。流式細(xì)胞分析的結(jié)果顯示，CD56brightCD16-uNK細(xì)胞中CD44的表達顯著低于自身外周血CD56br

7、ightCD16-NK細(xì)胞，二者分別為(34.65+9.96)％和(99.55±0.35)％。妊娠早期外周血CD56brightCD16-NK細(xì)胞CD44的表達和非孕期外周血CD56brightCD-16NK細(xì)胞相近，分別為(99.55+0.35)％和(99.66±0.29)％，但兩者差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 2.正常妊娠早期母胎界面中的OPN表達：在5例早期正常妊娠流產(chǎn)標(biāo)本中，蛻膜組織及絨毛組織中均有OPN mR

8、NA水平的表達。免疫組化顯示OPN強表達于所有標(biāo)本的子宮蛻膜組織腺上皮細(xì)胞、蛻膜基質(zhì)細(xì)胞以及絨毛組織中的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和合體滋養(yǎng)細(xì)胞。 結(jié)論： 1.妊娠早期子宮蛻膜的淋巴細(xì)胞主要為CD56brightcD16-uNK細(xì)胞，其免疫學(xué)表型與外周血CD56brightCD16-NK細(xì)胞有較大的區(qū)別，妊娠早期CD56brightCD16-uNK細(xì)胞低表達CD44，該表型可能與維持CD56brightCD16-uNK細(xì)胞對滋養(yǎng)層細(xì)

9、胞的低殺傷狀態(tài)有關(guān)，可能足維持母胎界面免疫耐受的重要因素。 2.人妊娠早期5-9周絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層和蛻膜組織中OPN呈強陽性表達，合體滋養(yǎng)細(xì)胞表達陰性或弱陽性，提示OPN可能參與正常妊娠早期uNK細(xì)胞聚集的過程。 第二部分 黃體酮對體外培養(yǎng)的人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞OPN的表達調(diào)控作用 目的： 探討黃體酮對體外培養(yǎng)的人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN表達的影響，初步了解OPN在uNK細(xì)胞聚集和母胎免疫平衡

10、中的作用。 方法： 1.采用混合酶消化法對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進行原代及傳代培養(yǎng)：2.不同濃度的黃體酮(0，10-7，5X10-7，10-6mol/1)刺激傳兩代培養(yǎng)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞72h；3.采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測在不同濃度黃體酮作用下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN mRNA表達變化；4.ELISA法檢測不同濃度黃體酮作用下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞上清中OPN蛋白濃度變化。 結(jié)果： 1.采用混合酶消化法獲得的人妊娠日.期蛻膜基

11、質(zhì)細(xì)胞懸浮時呈典型的卵圓形，接種半小時候后丌始貼壁，貼壁的細(xì)胞為纖維母細(xì)胞狀，呈較長的梭形和不規(guī)則星形，核呈卵圓形。24小時后細(xì)胞大多貼壁，3-5天可貼擘匯合。傳代后的蛻膜細(xì)胞生長迅速，2-3天即可鋪滿瓶底，鏡下細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形或不規(guī)則星形。傳三代后其形念無明顯變化，而傳代培養(yǎng)極性漸不明顯。波形蛋白免疫組化顯示體外培養(yǎng)傳代后的細(xì)胞95％以上為蛻膜基質(zhì)細(xì)胞。 2.黃體酮對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN的表達調(diào)控： (1)半定量R

12、T-PCR光密度值比值(OPN/β-actin)分析顯示：對照組(未加入黃體酮)為0.10±0.03、低劑量組(含10-7mol/1黃體酮)為0.46+0.13、中劑量組(含5x 10-7mol/1黃體酮)為0.9l士0.16、高劑量組(含10-6 mol/1黃體酮)為1.36+0.21。不同濃度黃體酮作用下蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中OPN mRNA水平隨著黃體酮濃度的增加而升高，與末加入黃體酮的對照組相比，差異性顯著(p<0.05)。 (

13、2)ELISA檢測對照組、低、中、高劑量組中培養(yǎng)上清中OPN蛋白的含量分別為4.5±2.16、14.16±3.26、29.62±2.78、52.86±5.68ng/ml，培養(yǎng)上清中OPN的蛋白水平隨著孕酮濃度增加而升高，與未加入孕酮的對照組相比，有顯著性差異(p<0.05)。 結(jié)論： 人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達OPN，黃體酮能調(diào)控其表達，且呈劑量依賴性增加。該結(jié)果提示了OPN可能是參與妊娠早期蛻膜組織中uNK細(xì)胞集聚的因