牙周膜相關(guān)蛋白-1(PLAP-1)對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 牙周膜又稱牙周韌帶(periodontalligament，PDL)是一種環(huán)繞牙根，并連接牙根和牙槽骨的致密結(jié)締組織。牙周膜細(xì)胞（periodontalligamentcells，PDLCs）具有成骨樣細(xì)胞特性，可以分化為成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞。但正常生理狀態(tài)下，牙周膜為堅(jiān)韌和富有彈性的組織，終生不發(fā)生骨質(zhì)化。體外研究發(fā)現(xiàn)，牙周膜相關(guān)蛋白-1(periodontalligament-associatedpro

2、tein-1，PLAP-1)與牙周組織這種保持自身穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡有密切關(guān)系。PLAP-1是通過研究人牙周膜中活性基因表達(dá)譜系而發(fā)現(xiàn)并定義的。在牙周組織的分化和礦化過程中，PLAP-1與其他生長因子之間保持一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)的平衡，防止牙周組織過度骨質(zhì)化;并且，在骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)病機(jī)制中，PLAP-1也是作為一個(gè)負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制軟骨的形成。
　　 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowstemcells，BMSCs)具有多向分化潛能

3、，根據(jù)不同的誘導(dǎo)條件，該細(xì)胞可分化為各種不同的細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與牙周成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后，BMSCs可具有牙周成纖維細(xì)胞的特性。且BMSCs取材簡便，增殖能力強(qiáng)，所以完全可以替代牙周膜成纖維細(xì)胞成為研究牙周組織再生的種子細(xì)胞。
　　 大鼠顱骨臨界骨缺損模型是骨組織工程中評(píng)價(jià)骨修復(fù)效果的經(jīng)典模型，大部分哺乳動(dòng)物的顱、頜面骨在形態(tài)學(xué)和胚胎起源上相似，即顱骨與頜骨均為單一的膜性化骨（下頜骨、蝶骨大翼除外）;在解剖

4、結(jié)構(gòu)上，顱骨與下頜骨均為由2層皮質(zhì)骨內(nèi)夾松質(zhì)骨構(gòu)成;在生理的角度上，顱骨的皮質(zhì)骨和萎縮的下頜骨相似。所以，該模型是理想的下頜骨缺損模型替代者。
　　 鑒于目前對(duì)PLAP-1的研究只局限于體外，本實(shí)驗(yàn)首次嘗試構(gòu)建超表達(dá)PLAP-1的大鼠BMSCs，通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timequantitativePCR，qPCR)技術(shù)鑒定并檢測成骨標(biāo)志基因的變化，隨后將其移植入Wistar大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損處，八周

5、后觀察PLAP-1對(duì)顱骨修復(fù)效能的影響，以期為進(jìn)一步研究其在牙周組織的穩(wěn)定和牙周炎中的作用提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 1、超表達(dá)PLAP-1影響大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 采用脂質(zhì)體法將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pBABE-hygro-PLAP-1，轉(zhuǎn)入293T病毒包裝細(xì)胞，用含有PLAP-1病毒的培養(yǎng)液感染大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，采用潮霉素B(HygromycinB)篩選獲得穩(wěn)

6、定超表達(dá)PLAP-1的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。采用細(xì)胞免疫化學(xué)的方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測PLAP-1蛋白和PLAP-1mRNA在大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步檢測各個(gè)成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，以正常大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和感染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞作對(duì)照。
　　 2、PLAP-1對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響
　　 采用牛Ⅰ型膠原制備膠原載體，培養(yǎng)細(xì)胞，并把膠原載體和細(xì)胞共培養(yǎng)，制備大鼠顱骨

7、缺損極限骨缺損模型，把膠原載體-細(xì)胞復(fù)合物移植入動(dòng)物顱骨缺損處，于8周時(shí)取材，通過標(biāo)本大體觀察、X線檢查、軟硬組織切片，HE染色，免疫組織化學(xué)染色，Masson染色，Kossa染色等方法，觀察骨修復(fù)的效果。
　　 結(jié)果:
　　 1、超表達(dá)PLAP-1抑制大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 經(jīng)HygromycinB篩選成功獲得穩(wěn)定超表達(dá)PLAP-1的BMSCs，RT-qPCR和免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證實(shí)

8、，轉(zhuǎn)染pBABE-hygro-PLAP-1后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有PLAP-1的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載體和正常BMSCs中PLAP-1mRNA和蛋白的表達(dá)均為陰性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示各相關(guān)成骨基因表達(dá)量降低。
　　 2、PLAP-1對(duì)Wistar大鼠顱骨缺損修復(fù)效能的影響
　　 經(jīng)標(biāo)本大體觀察、X線檢查、石蠟切片和硬組織切片HE染色，免疫組織化學(xué)染色，Masson染色，Kossa染色等方法觀察測定，以超表達(dá)P