淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復愈合的影響和機制的探討.pdf

1、目的:
　　 由于感染，外傷，腫瘤，先后天畸形，內分泌系統(tǒng)疾病造成的骨缺損，畸形，功能障礙，給患者的生活質量帶來很大的影響，尤其是對于口腔頜面部。因此尋找一種簡便、快捷、有效的方法促進骨創(chuàng)的修復，成為外科領域研究的熱點和難點。
　　 目前對如何促進骨愈合的研究很多。一些高分子生物材料植入，人工替代物植入，自體骨移植，組織工程化骨移植，低強度脈沖電磁場治療等均有一定療效，由于都存在或多或少的缺點，未能在臨床上廣泛應用。

2、r>　　 多年以來，國內外學者借助組織學、組織化學，組織形態(tài)計量學，生物力學等手段對骨創(chuàng)愈合進行了大量的實驗觀察，對骨創(chuàng)愈合機制也進行了廣泛的探討。近年來，由于基因技術的發(fā)展應用，人們對骨創(chuàng)愈合的認識已從細胞生物學向分子生物學水平深化，并隨著分子生物學的不斷發(fā)展，已經認識到骨創(chuàng)愈合與多種生長因子有關，除內分泌、代謝因子等全身因子外，骨創(chuàng)局部尚有大量的生長因子，對骨創(chuàng)愈合起著重要的調節(jié)作用，如:TGF-β(轉化生長因子)，VEGF(血管

3、內皮細胞生長因子)，FGF(成纖維細胞生長因子)，BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，神經生長因子(nervegrowthfactor，NGF)等。
　　 中藥對加速骨折愈合機理的實驗研究始自上世紀60年代，大致有如下幾個方面的成果:中藥改善骨折部的血液供應，促進血腫的吸收與機化;促進礦物質的沉積;增加成骨細胞的數量和活性，提高微量元素等。淫羊藿(Herbaepimedii)是一種傳統(tǒng)的補益中藥，臨床上用來治療骨折及與骨代謝有關的許多疾病

4、，并取得了良好的效果。研究結果表明，淫羊藿具有增強機體免疫功能，抗腫瘤，影響內分泌加強性腺功能、延緩衰老和影響心血管系統(tǒng)等多種重要的藥理活性。淫羊藿的有效活性成分淫羊藿苷(icariin，C33H40O15，分子量:676.67)，屬黃酮類化合物。李芳芳等將淫羊藿苷與大鼠卵泡顆粒細胞和腎上腺皮質細胞共同培養(yǎng)，顯示一定濃度的淫羊藿苷可促使卵泡顆粒細胞分泌雌二醇，高濃度時還可促進腎上腺皮質細胞分泌皮質類固醇，提示淫羊藿補腎壯陽功效:作用下丘

5、腦垂體-性腺軸及腎上腺軸，可有效調節(jié)體內激素的水平，改善骨代謝，促進蛋白質合成。由于淫羊藿苷在骨創(chuàng)愈合，修復中起到積極的作用，淫羊藿在促進骨愈合方面的研究成為研究熱點，淫羊藿提取物:淫羊藿苷對成骨細胞增殖代謝的影響，體外實驗董福生課題組已經完成。
　　 本研究通過制作新西蘭大白兔顱骨模型，術后采用淫羊藿苷灌胃，應用組織學和骨計量學方法，觀察在骨缺損不同的愈合階段，顱骨缺損區(qū)新生骨量，骨愈合速度和成骨質量。
　　 同時提取

6、顱骨缺損修復區(qū)新生骨組織mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，檢測成骨細胞促進骨生成的基因變化情況，進一步研究在新骨形成的過程中和應用淫羊藿苷治療后，相關基因的變化，相互聯系，尋找成骨的分子信號傳導通路。
　　 在以上研究的基礎上，通免疫組化方法，觀察新骨形成區(qū)骨鈣素和骨橋素的表達，初步探討淫羊藿苷促進骨形成的機制。為淫羊藿苷在促進骨愈合的臨床應用提供理論依據，奠定基

7、礎。
　　 方法:
　　 1、淫羊藿苷對兔顱骨缺損修復愈合質量的影響
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，隨機分為用藥組和對照組，制作顱骨缺損動物模型，用藥組術后給予淫羊藿苷灌胃，分別于術后4周、8周、12周處死動物，留取標本，拍射X線片觀察;制作組織切片，HE染色，觀察顱骨缺損區(qū)愈合情況;骨計量學觀察新骨形成區(qū)骨小梁平均寬度(TraberculaeWidth，Tb·Wiμm)，骨小梁面積比(Trabercular

8、AreaTb.Ar％)，成骨細胞個數(OsteoblastNumber,OB·N)，破骨細胞個數(OsteoclastNumber,OC·N)，觀察新骨形成區(qū)骨量的變化，研究淫羊藿苷對兔顱骨缺損愈合的影響。
　　 2、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復RANKL基因、RUNX2基因表達的影響
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，動物分組，動物模型制作，動物給藥方法和劑量同第一部分，分別于術后4周、8周、12周留取標本后，提取顱骨缺

9、損修復區(qū)新生骨組織mRNA，采用RT-PCR(realtime-polymerasechainreaction)方法，檢測成骨細胞促進骨生成的基因變化情況，本部分實驗所研究差異表達基因的重點:是關于成骨細胞增殖分化調節(jié)、成骨細胞功能調節(jié)和骨代謝調節(jié)等方面。
　　 3、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復區(qū)成骨相關蛋白骨鈣素、骨橋素的表達
　　 選用2月齡雌性新西蘭大白兔，動物分組，動物模型制作，動物給藥方法和劑量同第一部分，分別于

10、術后4周、8周、12周留取標本后，通過免疫組化方法，觀察新骨形成區(qū)成骨細胞骨基質蛋白的表達情況:骨鈣蛋白和骨橋蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1、淫羊藿苷對兔顱骨缺損修復愈合質量的影響
　　 1.1、一般觀察
　　 術后4周，對照組骨缺損區(qū)微凹陷，為纖維組織覆蓋，邊界清晰可辯，周邊未見明顯新骨形成。實驗組顱骨缺損區(qū)中央局部凹陷，邊界模糊不清，周圍可見少量薄、半透明新骨生長。
　　 術后8周，對照

11、組骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成，中央部略凹陷，較邊緣為薄。實驗組骨缺損區(qū)被均勻的硬組織覆蓋，與周邊骨質有明顯骨融合。
　　 術后12周，對照組骨缺損區(qū)表面及周邊部骨痂形成，形態(tài)基本接近正常顱骨外形。實驗組骨缺損區(qū)可見新形成的骨組織覆蓋，與邊緣無明顯界限。
　　 1.2、X線觀察
　　 術后4周，對照組骨缺損處為低密度影，骨缺損邊清晰。實驗組缺損處為低密度影，骨缺損邊緣模糊。
　　 術后8周，對照組骨缺損區(qū)

12、域密度低于缺損周圍骨質，與正常組織間界限明顯。實驗組骨缺損區(qū)域內密度略高于對照組，界限模糊，缺損范圍明顯縮小。
　　 術后12周，對照骨組缺損區(qū)域呈骨性低密度區(qū)，與正常組織間界限明顯。實驗組缺損區(qū)域與周圍骨質無明顯界限，密度基本一致。
　　 1.3、組織學觀察
　　 術后4周，對照組可見缺損邊緣有少量類骨質和新骨形成，中央為纖維組織，大量的炎性細胞廣泛浸潤。實驗組缺損區(qū)中央為纖維結締組織充填，可見粗大的膠原纖維，

13、中間散在少量炎性細胞，部分區(qū)域出現纖維骨樣結構，大量新生骨質，成骨細胞較多成柵欄狀排列在骨小梁周圍。
　　 術后8周，對照組缺損區(qū)存在大量結構疏松的纖維結締組織，且炎癥細胞仍廣泛存在，缺損區(qū)邊界有部分骨樣和纖維骨樣組織生成，其內有一定量的成骨細胞存在。實驗組缺損區(qū)內有大量骨質形成，骨小梁連續(xù)，增厚，形成板層結構，部分成網織狀，為較成熟骨，部分區(qū)域內骨質致密，形成板層狀骨，中央為骨髓腔。
　　 術后12周，對照組新生骨向中

14、央逐漸充填骨缺損，缺損內可見較多新生的編織骨及板層骨。骨小梁連續(xù)，細胞成分較少，纖維成分較實驗組多。實驗組骨缺損處為成熟骨質，骨細胞豐富，骨小梁粗大，排列整齊，較明顯的骨髓腔出現并連續(xù)。
　　 1.4、骨計量學觀察
　　 術后4周，用藥組與對照組比較:用藥組的松質區(qū)骨量(Tb·Ar％)，骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細胞個數(OB·N)均明顯大于對照組(P＜0.01);破骨細胞個數(CB·N)明顯低于對照組(P＜0.

15、01)。術后8周，用藥組與對照組比較:用藥組的松質區(qū)骨量（Tb·Ar％），骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細胞個數(OB·N)均明顯大于對照。組(P＜0.01);破骨細胞個數(CB·N)明顯低于對照組(P＜0.01)。術后12周，用藥組與對照組比較:用藥組的松質區(qū)骨量（Tb·Ar％），骨小梁寬度(Tb·Wiμm)，成骨細胞個數(OB·N)均明顯大于對照組(P＜0.01);破骨細胞個數(CB·N)兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)。<

16、br>　　 2、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修復RANKL基因、RUNX2基因表達的影響
　　 2.1、mRNA純度及完整性鑒定
　　 分光光度法測定結果顯示:對照組及用藥組總RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，純度及濃度符合實驗要求。
　　 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:對照組及用藥組總RNA經變性凝膠電泳后可見明顯的28S及18S條帶出現，28S條帶亮度約為18S條帶的兩倍，各組提取的RNA完整性良

17、好，符合實驗要求。
　　 2.2、Real-timePCR定量分析結果
　　 在術后4周，8周，12周時用藥組和對照組Rank1、Runx2基因的mRNA表達結果:在術后4周，8周，12周時Rank1基因表達水平用藥組均明顯低于對照組，Runx2基因的表達水平用藥組均明顯高于對照組。
　　 3、淫羊藿苷促進兔顱骨缺損修區(qū)成骨相關蛋白骨鈣素，骨橋素的表達
　　 3.1、骨鈣素OC在新骨形成區(qū)的表達
　

18、　 用藥后4周，實驗組骨鈣素OC的表達呈強陽性;對照組，OC在成骨細胞的胞漿和骨基質中陰性表達。8周時實驗組OC的表達呈強陽性，對照組呈弱陽性表達。12時周實驗組OC的表達呈強陽性，對照組呈弱陽性表達。
　　 3.2、骨橋素OPN在新骨形成區(qū)的表達
　　 用藥后4周實驗組骨橋素OPN在成骨細胞的胞漿中呈強陽性表達，在骨基質中呈強陽性表達，對照組呈陰性表達。8周時實驗組OPN的表達為強陽性;對照組呈弱陽性表達。12周時實

19、驗組OPN在呈強陽性表達;對照組呈弱陽性表達。
　　 結論:
　　 1、淫羊藿苷能夠增加兔顱骨缺損區(qū)成骨骨量，提高愈合質量。
　　 2、淫羊藿苷能夠促進兔顱骨缺損愈合，加快顱骨缺損的愈合速度。
　　 3、淫羊藿苷在成骨過程中，發(fā)揮雌激素樣作用，通過下調Rank1基因，減少破骨細胞的活化，抑制破骨細胞的功能，增加成骨。
　　 4、淫羊藿苷能上調成骨基因Runx2，通過經典Wnt/β-catenin途