神經(jīng)因素影響大鼠牙周組織缺損愈合過(guò)程的機(jī)制探討.pdf

1、背景和目的:
　　如何使因牙周病造成的病變牙周組織，特別是牙槽骨在“保質(zhì)”的前提下更有效地“增量”，使已松動(dòng)的患牙得以再次穩(wěn)固，并能正常行使牙齒的咀嚼功能是目前牙周病治療領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。以牙槽骨吸收破壞為主要特征的牙周病變組織，同時(shí)亦存在該部位的神經(jīng)血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的破壞，從發(fā)育生物學(xué)的觀點(diǎn)從發(fā)，牙周組織再生過(guò)程中神經(jīng)支配或許起到至關(guān)重要的作用。牙周病序列治療中，以各種基礎(chǔ)治療手段，消除炎癥，控制發(fā)展這一治療目標(biāo)已基本實(shí)現(xiàn)。但如

2、何促進(jìn)牙周組織的再生，特別是有質(zhì)有量的牙槽骨的再生，不論從臨床實(shí)踐，還是理論研究，都是值得不斷深化研究與探索的一個(gè)牙周學(xué)科領(lǐng)域的重要課題。
　　在現(xiàn)有眾多牙周組織再生治療的策略和相關(guān)研究中，以種子細(xì)胞、生物支架材料和各種生長(zhǎng)因子的研究較為熱門，但是由于牙周病病因及相應(yīng)組織修復(fù)機(jī)制的復(fù)雜性，以及機(jī)體調(diào)控組織再生的系統(tǒng)性，其所取得的研究結(jié)果并沒(méi)有達(dá)到我們所追求牙周組織再生的目標(biāo)。牙槽骨是全身骨組織中代謝最活躍的骨質(zhì)，神經(jīng)血管在牙槽骨改

3、建過(guò)程中的作用不容忽視，而現(xiàn)有的研究重點(diǎn)大多集中于如何獲得更多的再生組織卻忽略了這一過(guò)程中神經(jīng)與血管的再生，其獲得的再生牙周組織與天然的生理性牙周組織相比，在組織結(jié)構(gòu)牙槽骨密度及應(yīng)力方面均有很大的差距。顯然這種“簡(jiǎn)單還原”與組織的“自然形成”相比，忽略了機(jī)體生命現(xiàn)象的精確性。探索神經(jīng)對(duì)牙周組織再生過(guò)程的影響，在牙周組織再生研究領(lǐng)域中具有重要的意義。目前通過(guò)體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)神經(jīng)系統(tǒng)可以通過(guò)介導(dǎo)成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞的活性參與調(diào)節(jié)骨代謝，

4、在骨的修復(fù)改建過(guò)程中起著關(guān)鍵性的作用[1-2]。近年來(lái)，隨著中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨折愈合影響研究的深入，發(fā)現(xiàn)骨組織也是神經(jīng)作用的靶器官[3-4]，周圍神經(jīng)系統(tǒng)在骨折愈合及骨代謝中具有重要作用[5]。并且近期研究發(fā)現(xiàn)[6]，其主要是通過(guò)肽能神經(jīng)分泌的神經(jīng)肽對(duì)骨組織起作用的，而降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningenerelatedpeptide，CGRP)是骨組織中分布最為廣泛的一種神經(jīng)肽，主要分布于骨代謝活躍的部位，CGRP直接或間

5、接地通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化及活性來(lái)影響骨折愈合。早在Hukkanen研究大鼠骨折模型實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，便發(fā)現(xiàn)在新生骨組織中有CGRP免疫組織染色陽(yáng)性纖維長(zhǎng)入[7]，隨后CGRP的作用及機(jī)制也成為研究骨折愈合改建的熱點(diǎn)。
　　研究表明CGRP的陽(yáng)性神經(jīng)纖維在頜骨及其骨膜中均有分布，進(jìn)而推測(cè)其參與了生長(zhǎng)發(fā)育期的頜骨生長(zhǎng)形成和后期的修復(fù)改建過(guò)程[8-9]。降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)纖維在牙周組織中分布于磨牙牙周組織，牙槽骨以及牙槽骨中的

6、小動(dòng)脈和小靜脈周圍均有CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維的環(huán)繞，提示CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維在牙周組織再生過(guò)程中的神經(jīng)血管的再生有重要作用[10]。在口腔外科的研究中，針對(duì)CGRP在骨折愈合的研究較為廣泛，研究顯示CGRP可以促進(jìn)下頜骨骨折的愈合[11]。在正畸醫(yī)學(xué)研究中，CGRP對(duì)正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中牙槽骨的改建和重塑具有一定的調(diào)節(jié)作用。鑒于以上理論基礎(chǔ)，我們推測(cè)CGRP是牙周組織再生中必不可少的調(diào)節(jié)因子。本課題組已經(jīng)通過(guò)組織形態(tài)學(xué)觀察證明神經(jīng)可影響牙周

7、組織再生的質(zhì)量，并且通過(guò)免疫組織化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)CGRP在牙周組織再生過(guò)程中的表達(dá)變化，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，通過(guò)分子水平檢測(cè)進(jìn)一步探討CGRP在牙周組織再生過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、離斷下牙槽神經(jīng)后大鼠牙周組織中CGRP及SP的表達(dá)變化
　　建立離斷大鼠下牙槽神經(jīng)的動(dòng)物模型，左側(cè)離斷神經(jīng)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)保留神經(jīng)為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)分為六組即0天、3天、7天、14天、21天、28天。采用Realtime-PCR及West

8、ernBlot方法檢測(cè)大鼠牙周組織中CGRP以及SP的表達(dá)變化。
　　2、失下牙槽神經(jīng)對(duì)大鼠牙周組織愈合過(guò)程中CGRP、SP及骨改建相關(guān)因子表達(dá)變化的研究
　　建立離斷大鼠下牙槽神經(jīng)伴牙周缺損模型，左側(cè)切斷大鼠下牙槽神經(jīng)伴牙周缺損為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)側(cè)保留神經(jīng)僅做牙周缺損為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分為五組即1周、2周、4周、6周和8周。采用Realtime-PCR及WesternBlot方法檢測(cè)大鼠牙周組織中神經(jīng)相關(guān)因子CGRP、SP及骨改建相

9、關(guān)因子OPG、RANKL的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、離斷下牙槽神經(jīng)后大鼠牙周組織中CGRP及SP的的表達(dá)變化
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示失神經(jīng)后牙齦及牙槽骨中的CGRP和SP均呈現(xiàn)先降低后上升至正常水平的趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示3天、7天和14天組與正常組織表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，WesternBlot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，失神經(jīng)后，大鼠牙周組織中的SP蛋白表達(dá)水平總體趨勢(shì)與SPmRNA的變化基本相

10、同，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，術(shù)后第3天、7天、14天和21天的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。WesternBlot檢測(cè)CGRP蛋白結(jié)果為陰性。
　　2、失下牙槽神經(jīng)對(duì)大鼠牙周組織愈合過(guò)程中CGRP、SP及骨改建相關(guān)因子表達(dá)變化的研究
　　通過(guò)Realtime-PCR方法檢測(cè)方法顯示牙周組織中實(shí)驗(yàn)組的CGRPmNRA水平在前期表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，從第4周開(kāi)始逐漸升高，直至第八周CGRPmNRA水平的水平仍處于升高