重組核小體通用性Th表位誘導(dǎo)SLE口服免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及研究目的 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種慢性、累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，好發(fā)于青年女性，其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，發(fā)病率有逐漸增高趨勢(shì)。目前臨床上主要以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合環(huán)磷酰胺等非特異性免疫抑制劑治療為主，雖然可以在一定程度上控制病情進(jìn)展，但由于疾病的進(jìn)展和長(zhǎng)期治療帶來的毒副作用使SLE患者的平均壽命明顯短于正常人。這種以免疫系統(tǒng)的普遍抑制為代價(jià)的療法，在發(fā)揮治療作用的同時(shí)，往往也造成患者多器官或系統(tǒng)

2、的損傷。因此有必要探索一種可控性的免疫治療措施，這種措施只抑制特定的自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞克隆，這是SLE等自身免疫性疾病防治研究的方向，其中治療或預(yù)防性肽耐受疫苗被認(rèn)為最具發(fā)展前景。 應(yīng)用特異性抗原誘導(dǎo)免疫耐受治療自身免疫病已有很長(zhǎng)歷史。該方法可高度選擇性地抑制針對(duì)特定抗原的淋巴細(xì)胞克隆，而對(duì)機(jī)體正常免疫功能基本沒有影響，克服了傳統(tǒng)化學(xué)類藥物的毒副作用。早期多應(yīng)用完整抗原來進(jìn)行免疫耐受的研究取得較好效果，但應(yīng)用結(jié)構(gòu)復(fù)雜抗原作為耐受

3、原存在易激發(fā)自身免疫的缺陷，且來源也比較困難。目前已明確不論是內(nèi)源性或外源性抗原必須經(jīng)過APC內(nèi)部的蛋白酶降解以后，以短肽表位-MHC復(fù)合物的形式提呈在APC表面，才能被T細(xì)胞受體識(shí)別，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化。由于器官特異性和非器官特異性AID一般由T細(xì)胞直接介導(dǎo)或T細(xì)胞調(diào)節(jié)，因此誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受在理論上便可以預(yù)防或治療AID。且相對(duì)于B細(xì)胞，誘導(dǎo)T細(xì)胞的免疫耐受相對(duì)容易，需要的抗原量較少，維持時(shí)間較長(zhǎng)。與完整或大分子抗原相比

4、，肽疫苗更容易誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，而且可大規(guī)模化學(xué)合成，易于純化，使用也相對(duì)安全?；谏鲜隼碚摚米陨砜乖腡h細(xì)胞表位代替完整抗原進(jìn)行AID的免疫耐受，即制備治療性肽耐受疫苗逐漸成為AID防治研究的熱點(diǎn)。 自身抗原表位的篩選和鑒定是AID耐受性肽疫苗研究的關(guān)鍵。誘導(dǎo)SLE發(fā)病的自身抗原來自于凋亡的外周血單一核細(xì)胞，種類繁多，目前已明確核小體是誘導(dǎo)SLE發(fā)病及介導(dǎo)組織損傷的重要或關(guān)鍵致病性抗原，阻斷核小體的免疫病理反應(yīng)具有潛在的防

5、治SLE的意義。國外一些研究顯示，核小體T細(xì)胞表位肽H2B10-33、H416-39和H471-94等均能通過靜脈注射的途徑取得較好免疫耐受效果，具體表現(xiàn)在核小體表位肽可以阻斷狼瘡鼠致病性抗體的產(chǎn)生，推遲狼瘡性腎炎的發(fā)生時(shí)間，阻止疾病進(jìn)展，延長(zhǎng)生存時(shí)間。因此，本實(shí)驗(yàn)在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合我科郝進(jìn)博士篩選確定的H2B14-28是H2B組蛋白Th細(xì)胞免疫優(yōu)勢(shì)表位之一，并通過靜脈注射表位肽證實(shí)其能誘導(dǎo)SLE癥狀鼠免疫耐受，將表位肽H2B14

6、-28通過減毒鼠傷寒沙門菌直接在腸道內(nèi)表達(dá)誘導(dǎo)SLE口服免疫耐受在理論上是可行的。 pCDR1是國外實(shí)驗(yàn)室針對(duì)鼠病原性抗DNA抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1)篩選和鑒定出的潛在免疫優(yōu)勢(shì)Th細(xì)胞表位(16/6基因型)，用于預(yù)防或治療狼瘡鼠的SLE樣癥狀的研究。研究發(fā)現(xiàn)，pCDR1靜脈注射，可改善免疫原誘導(dǎo)的BALB/c狼瘡鼠、(NZBxNZW)F1鼠狼瘡樣癥狀，有腎臟內(nèi)免疫復(fù)合物沉積和蛋白尿的鼠數(shù)量減少，提示使用pCDR1能夠預(yù)防SL

7、E樣癥狀的發(fā)生。因此，我們同時(shí)選擇pCDR1作為Th細(xì)胞表位對(duì)照肽。 口服耐受相對(duì)于其他免疫耐受誘導(dǎo)途徑，具有安全性好，少見激發(fā)自身免疫的現(xiàn)象，而且方便、可操作性強(qiáng)，沒有劑量的嚴(yán)格限制。應(yīng)用口服耐受治療一些自身免疫性疾病目前已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期甚至Ⅱ期的臨床實(shí)驗(yàn)。然而，直接口服表位(10-20個(gè)氨基酸的短肽)在腸道內(nèi)容易降解，且價(jià)格昂貴。減毒鼠傷寒沙門菌能靶向感染樹突狀細(xì)胞等專職APC，是目前較常用的口服疫苗載體，具有安全、無副作用、易

8、于給藥且具有長(zhǎng)時(shí)間保護(hù)作用的特點(diǎn)。作為工程菌能直接在腸壁表達(dá)表位肽(使所需表達(dá)的蛋白無需在體外產(chǎn)生、分離、純化和鑒定)，而且表達(dá)的蛋白可直接通過腸壁微褶細(xì)胞傳遞給抗原提呈細(xì)胞，有效避免目的蛋白的降解。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用以減毒鼠傷寒沙門氏菌作為工程菌直接在腸壁表達(dá)核小體表位的形式，來進(jìn)行SLE口服耐受的研究。并將CTLA4-Ig基因同時(shí)轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門氏菌中，通過競(jìng)爭(zhēng)性阻斷B7與CD28結(jié)合，進(jìn)一步控制腸上皮DCs可能發(fā)生的活化，誘導(dǎo)調(diào)

9、節(jié)性T細(xì)胞和無能性T細(xì)胞的生成，達(dá)到預(yù)防和治療SLE的最終目的。 基于上述理由，本課題用減毒鼠傷寒沙門菌SL7207、X4550(asd突變株)作為工程菌，設(shè)計(jì)引物，通過touchdownPCR法構(gòu)建具有分泌表達(dá)CTLA4-Ig-H2B14-28、CTLA4-Ig-pCDR1和CTLA4Ig融合蛋白的重組真核表達(dá)載體，并通過重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞、Westernblot、免疫組化檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。同時(shí)將H2B14-28和pCDR

10、1Th細(xì)胞表位分別通過全基因合成等基因克隆的方法，構(gòu)建到能在X4550中攜帶的asd+質(zhì)粒pYA3149上，經(jīng)修飾后再電轉(zhuǎn)入X4550，構(gòu)建重組菌株X4550(pYA3149-H2B14-28)和X4550(pYA3149-pCDR1)，在體外誘導(dǎo)表達(dá)，Dotblot驗(yàn)證重組菌對(duì)表位肽的表達(dá)。 將重組菌株喂飼BALB/c小鼠，用凋亡的同系淋巴細(xì)胞制備SLE癥狀模型，觀察誘導(dǎo)口服免疫耐受的效果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)基因

11、庫中H2B14-28、pCDR1和人CTLA4-Ig的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物，將細(xì)胞表位設(shè)計(jì)在下游引物中，以pCTLA4-Ig-IRES2-EGFP為模板，通過touchdownPCR法從擴(kuò)增出CTLA4-Ig，同時(shí)引入表位基因。HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后定向插入pCDNA3.1(+)載體，陽性質(zhì)粒的酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，48h后細(xì)胞裂解上清進(jìn)行免疫印跡和免疫組化，結(jié)果表明，pcDNA

12、3.1(+)-CTLA4-Ig-H2B、pcDNA3.1(+)-CTLA4-Ig-pCDR1和pcDNA3.1(+)-CTLA4-Ig質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞均有融合蛋白的表達(dá)。將重組菌株喂飼BALB/c鼠，取脾臟分別以羊抗人CTLA-4多克隆抗體和抗表位肽多克隆抗體為一抗免疫組化顯示在脾臟細(xì)胞中散在胞漿呈黃褐色的陽性細(xì)胞，說明在體內(nèi)有融合蛋白的表達(dá)。 全基因合成H2B14-28和pCDR1，在多肽羧基端(C端)引入6-His標(biāo)簽，等摩爾比

13、混合后退火互補(bǔ)，與表達(dá)載體pYA3149連接，陽性質(zhì)粒的酶切鑒定和基因測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。體外IPTG誘導(dǎo)重組菌株X4550(pYA3149-H2B14-28)和X4550(pYA3149-pCDR1)表達(dá)蛋白，將誘導(dǎo)后的細(xì)菌裂解上清直接點(diǎn)膜行斑點(diǎn)印跡，用鼠抗His單抗作一抗顯示有陽性表達(dá)，從而證實(shí)我們構(gòu)建的重組菌株能表達(dá)目的蛋白。體外傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在有選擇壓力下傳代后的重組菌株，所含重組質(zhì)粒均保持較高穩(wěn)定性，95％以上無

14、重組質(zhì)粒的丟失。在無選擇壓力組，僅70％～80％仍保有重組質(zhì)粒。體內(nèi)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組菌可成功定居于脾臟、Peyer's結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)上述組織，且其中的活菌計(jì)數(shù)和組織內(nèi)活菌質(zhì)粒的陽性率均隨口服接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)。 結(jié)論 1.用基因工程原理和方法，成功構(gòu)建了能在減毒鼠傷寒沙門菌中表達(dá)的核小體Th細(xì)胞表位H2B14-28和CTLA4-Ig的重組表達(dá)質(zhì)粒，并同時(shí)構(gòu)建分別表達(dá)CTLA4-Ig、CTLA4

15、-Ig-pCDR1、pCDR1和H2B14-28等的對(duì)照組質(zhì)粒。在體外，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過DOTAP法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，Westernblot、細(xì)胞免疫組化和Dotblot鑒定表達(dá)的是目的蛋白。 2.將構(gòu)建表達(dá)CTLA4-Ig-H2B、CTLA4-Ig-pCDR1和CTLA4-Ig的減毒鼠傷寒沙門菌SL7207喂飼Balb/c小鼠，取脾臟進(jìn)行免疫組化鑒定重組蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在脾臟免疫細(xì)胞胞漿

16、中有陽性表達(dá)，說明我們構(gòu)建的重組真核表達(dá)質(zhì)粒能通過減毒鼠傷寒沙門菌被攜帶到動(dòng)物體內(nèi)，并在體內(nèi)成功表達(dá)有生物學(xué)活性的蛋白。 3.以同系凋亡淋巴細(xì)胞免疫BALB/c小鼠制備SLE樣癥狀小鼠模型，給予口服免疫構(gòu)建的重組減毒鼠傷寒沙門菌菌株進(jìn)行免疫耐受的誘導(dǎo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組相比，CTLA4-Ig-H2B能明顯降低實(shí)驗(yàn)小鼠ANA、ds-DNA和抗核小體抗體等自身抗體的水平，對(duì)白細(xì)胞減少和蛋白尿有明顯的改善作用，對(duì)腎臟損傷有明顯的保護(hù)