口服抗原誘導(dǎo)免疫性血小板減少模型T細(xì)胞耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)，也稱自身免疫性血小板減少性紫癜(autoimmune thrombocytopenic purpura，AITP)，是臨床最為常見(jiàn)的出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30％。本病的實(shí)質(zhì)是一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要是由于人體自身免疫耐受機(jī)制被打破，體液免疫和細(xì)胞免疫紊亂，產(chǎn)生抗自身血小板抗體或激活細(xì)胞毒T細(xì)胞，導(dǎo)致血小板破

2、壞增加和/或生成障礙。 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于ITP的一、二線治療以腎上腺皮質(zhì)激素、靜脈丙種球蛋白及脾切除為主，但仍有25％～30％的患者上述治療無(wú)效或短期內(nèi)復(fù)發(fā)，成為難治性ITP，遷延不愈，甚至危及生命，對(duì)這部分患者目前有名目繁多的非常規(guī)治療比如免疫抑制劑、骨髓移植等，但是常常缺乏有效性和安全性。因此亟需探索更為有效和安全的治療方法。 自身免疫性疾病的發(fā)生主要與自身免疫耐受的破壞有關(guān)，因此去除導(dǎo)致耐受破壞的因素或再次誘導(dǎo)對(duì)自

3、身抗原的耐受，有助于控制自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)研究人員從自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理的不同角度出發(fā)，開(kāi)始探尋一些新型的免疫治療方法，有些方法已逐步應(yīng)用于臨床試驗(yàn)。 口服耐受(oral tolerance)是通過(guò)腸道粘膜接觸抗原而誘導(dǎo)的一種免疫應(yīng)答低下?tīng)顟B(tài)，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受的重要方法之一?？诜褪艿拇_切機(jī)制迄今尚不清楚，目前認(rèn)為其形成機(jī)制主要依賴于口服抗原的劑量：低劑量口服抗原可刺激調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(包括CD4+CD25h

4、igh Tr細(xì)胞、CD8+CD28-Ts細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞等)的分化，引起主動(dòng)性免疫抑制(active suppression)，其機(jī)制可能是通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子(如TGF-β、IL-4、IL-10等)，誘導(dǎo)以Th2和Th3應(yīng)答為主的效應(yīng)，即發(fā)生“免疫偏離”。而這種主動(dòng)性抑制還能作用于非特異性免疫應(yīng)答，即旁路抑制(bystander suppression)；高劑量口服抗原可導(dǎo)致T細(xì)胞克隆缺失(clonal deletion

5、)和/或克隆無(wú)能(clonal anergy)，誘導(dǎo)耐受的產(chǎn)生。另外，何種機(jī)制占優(yōu)勢(shì)還與口服抗原的時(shí)間、形式及次數(shù)有關(guān)?？诜褪芫哂袘?yīng)用方便，無(wú)明顯毒性，且不必明確特異性自身抗原的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，因此為治療自身免疫性疾病提供了新的途徑和思路?？诜褪軕?yīng)用于T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病動(dòng)物模型的防治已有不少成功的報(bào)道，如自身免疫性腦脊髓炎、膠原或佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病(NOD小鼠)、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性重癥肌無(wú)力等，且多發(fā)性硬化、

6、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎等已有臨床試驗(yàn)報(bào)道。 基于ITP的自身免疫性發(fā)病機(jī)制，應(yīng)用口服抗原誘導(dǎo)免疫耐受的研究具有可行性。已有前期研究應(yīng)用口服自身血小板治療ITP，雖然存在獲取足夠自身血小板的困難和血小板保存方法的局限，但是這種方法具備極大的潛在優(yōu)勢(shì)，如自身抗原的易接近性(血小板膜糖蛋白)、評(píng)價(jià)指標(biāo)的客觀性(血小板計(jì)數(shù))等，而且除了自身血小板，已有專家指出還可以應(yīng)用同種異體血小板、培養(yǎng)的自身血小板以及分離純化

7、的血小板糖蛋白如GPⅡb/Ⅲa。 ITP動(dòng)物模型的建立有利于闡明ITP的發(fā)病機(jī)制，分析藥物的治療作用，并進(jìn)一步探討新的治療方法。一個(gè)理想的ITP動(dòng)物模型應(yīng)該能模擬人類ITP的所有特點(diǎn)，如易感性、發(fā)病機(jī)制和臨床過(guò)程，同時(shí)具備可操作性和穩(wěn)定性。數(shù)十年來(lái)，已有眾多的造模方法應(yīng)用于ITP的研究，如抗血小板血清及多/單克隆抗體造模方法、(NZW×BXSB)F1小鼠自發(fā)模型等。 我們參照國(guó)外有關(guān)文獻(xiàn)加以改進(jìn)，用主動(dòng)免疫法建立理想的I

8、TP動(dòng)物模型，并通過(guò)喂食血小板抗原，研究口服耐受對(duì)ITP的防治作用，并探討其可能機(jī)制。 第一部分免疫性血小板減少(ITP)小鼠模型的建立 目的：建立ITP小鼠模型，初步探討其體液及細(xì)胞免疫機(jī)制; 方法：應(yīng)用Wistar大鼠血小板(模型組)或PBS(對(duì)照組)腹腔免疫CBA/CaJ小鼠，每周取血檢測(cè)血常規(guī)，監(jiān)測(cè)血小板計(jì)數(shù)及平均血小板體積(MPV)水平的變化，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板相關(guān)抗體(PAIgG)，應(yīng)用Wes

9、tern blot技術(shù)檢測(cè)血小板洗脫抗體特異性，應(yīng)用CCK-8檢測(cè)特異性抗血小板淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，應(yīng)用EIASA試劑盒檢測(cè)血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平，同時(shí)觀察骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)，尤其是巨核細(xì)胞系的數(shù)量和發(fā)育情況。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組血小板計(jì)數(shù)于初次免疫后第3周達(dá)第一個(gè)低谷，第6周達(dá)第二個(gè)低谷(P＜0.05)，第8、9周降至最低(P＜0.01)，第10周驟然回升至正常甚至更高，MPV相應(yīng)地逐漸增大再逐漸

10、恢復(fù)，而骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量均無(wú)顯著變化；免疫機(jī)制研究顯示PAIgG顯著增高(P＜0.05)，Westernblot顯示血小板洗脫抗體可與與GPIbα(CD42b)分子量相當(dāng)?shù)牡鞍捉Y(jié)合，特異性抗血小板淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)(P＜0.05)；與免疫前相比，模型組血漿IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平均有所增高(P＜0.05)，分別于免疫后第6周、第3和7周、第4周、第4周達(dá)峰值，第10周均降至正常水平。 結(jié)論：基于抗原

11、模擬原理成功建立了理想的、穩(wěn)定的、最大程度模擬人體的ITP小鼠模型，不僅發(fā)病過(guò)程與人類ITP相似，而且發(fā)病機(jī)制亦與人類ITP相符，為ITP的實(shí)驗(yàn)研究提供了有力的工具。 第二部分小鼠GPIbα(CD42b)GST融合蛋白的原核表達(dá)及其誘導(dǎo)ITP小鼠模型口服耐受的初步研究 目的：構(gòu)建小鼠GPIbα(CD42b)原核表達(dá)載體，制備GPIba-GST融合蛋白，并探討經(jīng)口服途徑GPIbα-GST融合蛋白對(duì)ITP小鼠模型的防治作用及

12、可能機(jī)制。 方法：將小鼠GPIbα的開(kāi)放讀碼框分成四個(gè)片段，片段之間有10-15個(gè)氨基酸的重疊，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增目的基因，重組到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1中，用限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序法進(jìn)行鑒定，IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pGexGPIbα轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)，通過(guò)SDS-PAGE、Western blot分析表達(dá)產(chǎn)物，大量表達(dá)后經(jīng)谷胱甘肽Sepharose 4B親和層析獲得純化產(chǎn)物。按不同劑量(高、中、低)將I

13、TP小鼠模型分組，每組4-6只，以灌胃針喂食實(shí)驗(yàn)小鼠純化GPIbα/GST融合蛋白(耐受組)或PBS(溶劑對(duì)照組)，并設(shè)空白對(duì)照組(免疫PBS，口服PBS)，觀察血小板參數(shù)，檢測(cè)PAIgG以及血漿IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β水平，同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血、脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD25high 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例(％CD4+CD25high/CD4+)。 結(jié)果：限制性內(nèi)切酶酶

14、切和DNA測(cè)序分析證實(shí)成功獲得小鼠GPIba四個(gè)基因片段，并準(zhǔn)確克隆入pGEX-6P-1，pGexGPIbα經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出分子量與理論值相符的GST融合蛋白，其中GST/GPIbα1-214和GST/GPIbα306-537為可溶性表達(dá)，GST/GPIbα198-315和GST/GPIbα527-734為包涵體表達(dá)，用變性復(fù)性方法獲得目的蛋白，另外免疫印跡法證實(shí)GST/GPIbα306-537能與抗小鼠GPIbα(CD42b)單克隆抗體特

15、異性結(jié)合，純化后的目的蛋白純度均達(dá)90％以上?？诜褪軐?shí)驗(yàn)中，與溶劑對(duì)照組相比，高劑量耐受組血小板減少的幅度緩和，血小板降至最低的時(shí)間延遲至第10周，血小板減少的持續(xù)時(shí)間縮短至1～2周(P＜0.05)，MPV變化不顯著，PAIgG水平降低；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組各組織的％CD4+CD25high/CD4+明顯減低(P＜0.05)，而高劑量耐受組雖然亦有所減低，但未達(dá)顯著水平；與溶劑對(duì)照組相比，高劑量耐受組各

16、組織的％CD4+CD25high/CD4+平均水平均有所增加，但無(wú)顯著差異；血漿細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，溶劑對(duì)照組IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平增高(P＜0.01)，TGF-β水平降低(P＜0.01)，而高劑量耐受組IL-4、IL-10水平增高(P＜0.01)，IFN-γ水平有所增高，IL-2、TGF-β水平有所降低，但均未達(dá)顯著水平；與溶劑對(duì)照組相比，高劑量耐受組IL-2、IFN-γ,、IL-10水平降低