慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜中誘導(dǎo)血小板特異性T細(xì)胞免疫耐受的機(jī)制研究.pdf

1、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜(Chronic idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是以免疫介導(dǎo)的血小板破壞過多為特征的一種出血性疾病。臨床上以粘膜出血，病程長，反復(fù)發(fā)作為特點(diǎn)。50％～60％的患者體內(nèi)可檢測到一種或幾種針對血小板糖蛋白的自身抗體，其中約75％的抗血小板自身抗體是針對血小板糖蛋白GPIIb/IIa和Ib/IX的，該抗體與血小板膜表面糖蛋白結(jié)合，隨后致敏的血小板通過Fc受體被巨噬細(xì)胞

2、吞噬或因補(bǔ)體活化而破壞。然而迄今為止，ITP的治療仍以非特異性免疫抑制療法為主，還未出現(xiàn)針對血小板反應(yīng)性T細(xì)胞或B細(xì)胞的抗原特異性免疫抑制療法。 B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體需要自身抗原特異性T細(xì)胞的參與。研究表明ITP患者在T細(xì)胞亞群及功能等很多方面都可發(fā)現(xiàn)異常。更有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在ITP患者外周血中存在針對GPIIb/Ⅲa等血小板膜蛋白的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞。自身反應(yīng)性T細(xì)胞識別血小板抗原特定表位，進(jìn)而活化，分泌細(xì)胞因子，并與相應(yīng)

3、B細(xì)胞直接作用，激活B細(xì)胞，B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞，導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生。因此，誘導(dǎo)GP反應(yīng)性CD<,4><'+>T細(xì)胞免疫失活將有可能為慢性ITP靶向性治療提供新的思路。 第一部分 CTLA4-Ig誘導(dǎo)的無能T細(xì)胞在慢性ITP中的免疫調(diào)節(jié)作用 目的：T淋巴細(xì)胞活化增殖并引起免疫應(yīng)答需要雙信號刺激：細(xì)胞受體(TCR或BCR)與抗原結(jié)合所提供的活化起始信號，即第一信號：細(xì)胞表面輔助分子與相應(yīng)配體結(jié)合所提供的協(xié)同共刺激信號，即

4、第二信號。兩個信號缺一不可，如果缺失第一信號或傳遞受阻則免疫反應(yīng)無法進(jìn)行；如果缺失第二信號或傳遞受阻，則會導(dǎo)致T細(xì)胞對供體抗原的特異性免疫耐受狀態(tài)，即T細(xì)胞無能?？梢姽泊碳ば盘枂?、維持并調(diào)節(jié)活化級聯(lián)反應(yīng)，為細(xì)胞抗原特異性激活所必需，決定了細(xì)胞是活化增殖、抑或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o能狀態(tài)(anergy)甚至凋亡(apoptosis)。T細(xì)胞無能是確保機(jī)體T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性耐受的主要機(jī)制之一，它的無反應(yīng)狀態(tài)不是被動的，而是具有主動的抑制效應(yīng)。許多研究

5、發(fā)現(xiàn)，無能T細(xì)胞可以主動抑制具有相同抗原特異性的其它效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，并通過細(xì)胞--細(xì)胞接觸抑制與之具有相同抗原特異性的T淋巴細(xì)胞的增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)反應(yīng)性T細(xì)胞對特異性抗原的耐受，產(chǎn)生傳染性耐受(infectious tolerance)或稱連鎖性抑制(linked suppression)效應(yīng)。 已有大量動物實(shí)驗(yàn)通過誘導(dǎo)無能T細(xì)胞能延長骨髓移植患者的存活時間，抑制變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的慢性復(fù)發(fā)過程、抑制重癥肌無力的發(fā)生

6、、減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀。本課題通過誘導(dǎo)血小板糖蛋白(GP)特異性無能T細(xì)胞，誘導(dǎo)GP反應(yīng)性T細(xì)胞耐受。并研究GP特異性無能T細(xì)胞的作用機(jī)制。 方法： *制備人GPIIb/Ⅲa、GPIb/IX抗原； *分離采集外周血單個核細(xì)胞(PBMC)； *GPIIb/Ⅲa、GPIb/IX反應(yīng)性T細(xì)胞系的建立； *利用CTLA4-Ig誘導(dǎo)GP特異性無能T細(xì)胞； *人外周血樹突狀細(xì)胞(DC)的體外誘導(dǎo)及

7、鑒定； *樹突狀細(xì)胞T細(xì)胞活化能力的檢測； *無能T細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)：①無能T細(xì)胞抑制效應(yīng)檢測；②細(xì)胞因子阻斷實(shí)驗(yàn)；③無能T細(xì)胞抗原特異性實(shí)驗(yàn)。 *ELISA方法檢測培養(yǎng)體系中IL-10和TGF-β1水平： *Transwell實(shí)驗(yàn)； *無能T細(xì)胞對B細(xì)胞抗體產(chǎn)生的抑制作用。 *統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果： 1 ITP患者成熟樹突狀細(xì)胞T細(xì)胞活化能力顯著高于健康者(P<0.05)；不成熟

8、樹突狀細(xì)胞的T細(xì)胞活化能力與健康者沒有顯著差別。 2 ITP患者CTLA4-Ig誘導(dǎo)的GP特異性無能T細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中能顯著抑制自體GP反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖。此抗原特異性抑制效應(yīng)依賴于抗原遞呈細(xì)胞的存在。 3 CTLA-Ig誘導(dǎo)的GP特異性無能T細(xì)胞不依賴于抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β1發(fā)揮抑制效應(yīng)，細(xì)胞一細(xì)胞接觸是無能T細(xì)胞發(fā)揮作用的必備條件。其抑制效應(yīng)并非組成性的，需要特異性抗原的刺激。 4 CTLA4

9、-Ig誘導(dǎo)的GP特異性無能T細(xì)胞抑制了ITP患者自體樹突狀細(xì)胞的T細(xì)胞活化能力，使DC細(xì)胞獲得了致耐受性。 5 CTLA4-Ig誘導(dǎo)的GP特異性無能T細(xì)胞可以顯著抑制ITP患者自體B細(xì)胞分泌抗血小板抗體。 結(jié)論： CTLA4-Ig誘導(dǎo)的GP特異性無能T細(xì)胞通過抑制抗原遞呈細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞的T細(xì)胞活化能力，抑制ITP患者GP反應(yīng)性T細(xì)胞活化增殖，特異性抑制B細(xì)胞分泌抗血小板抗體。 第二部分由CD4+CD2

10、5-T細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板糖蛋白特異性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在慢性ITP中的免疫調(diào)節(jié)作用 目的：CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)是不同于Th1和Th2的具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體。自然產(chǎn)生(naturally occuring)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以非抗原特異性的抑制T細(xì)胞活化和增殖。但是抗原特異性的Treg則可以產(chǎn)生抗原特異性的免疫抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，ITP發(fā)病

11、時自然產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg細(xì)胞明顯減少，CD4+CD25+Treg細(xì)胞在ITP發(fā)病中可能起重要作用。因此，本課題擬由ITP患者外周血CD4+CD25-T細(xì)胞誘導(dǎo)GP特異性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并研究其誘導(dǎo)免疫耐受的效果和作用機(jī)制。 方法： *制備人GPIIb/Ⅲa、GPIb/IX抗原； *分離采集外周血單個核細(xì)胞(PBMC)： *GPIIb/Ⅲa、GPIb/IX反應(yīng)性T細(xì)胞系的建立：

12、 *人外周血樹突狀細(xì)胞(DC)的體外誘導(dǎo)及鑒定： *免疫磁珠法從ITP患者外周血分選CD4+CD25-T細(xì)胞； *體外誘導(dǎo)擴(kuò)增GP特異性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； *ELISA方法檢測培養(yǎng)體系中IL-10和TGF-β1水平； *Transwell實(shí)驗(yàn)： *GP特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制效應(yīng)檢測；細(xì)胞因子阻斷實(shí)驗(yàn)；GP特異性Treg抗原特異性實(shí)驗(yàn)。 *混合淋巴

13、細(xì)胞反應(yīng)，檢測GP特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作用后樹突狀細(xì)胞T細(xì)胞活化能力的改變； *微陣列芯片分析：細(xì)胞RNA的提取；對樣品RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記；雜交與清洗；芯片掃描；芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析；芯片結(jié)果的分析； *22K Human Genome Array芯片的質(zhì)量控制； *實(shí)時熒光定量PCR檢測； *統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1、由慢性ITP患者外周血CD4+CD25-T細(xì)胞可以誘導(dǎo)出GP特異性C

14、D4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞，該調(diào)節(jié)T細(xì)胞可以顯著抑制ITP患者GP反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)GP特異性免疫耐受。 2、GP特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)需要細(xì)胞--細(xì)胞接觸，并且不依賴于抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β1。 3、GP特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)具有抗原特異性，并且此抑制效應(yīng)為非組成性的，它需要抗原的不斷刺激。 4、與GP特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞共同孵育后，ITP患者DCs獲得致耐受性，該致耐受性D

15、Cs可進(jìn)一步誘導(dǎo)其他GP反應(yīng)性T細(xì)胞免疫耐受。 5、免疫相關(guān)基因如TLR8、FasL、TGFBR3、DLL1、JAG2、CD200、TLR8、IL-1β、、MyD88、IFNGR1、IFNGR2、CCL17、CD209、RANK等可能參與了GP特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的過程。 6、TLR、Notch、IFN-γ和TGF-β信號通路可能參與了GP特異性調(diào)節(jié)T細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的過程，其中TLR通路的作用可能最為重要。