半枝蓮黃酮類化合物抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與基底膜黏附的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多種腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后均與腫瘤血管生成密切相關(guān)，這個(gè)復(fù)雜的多步驟過程中包括黏附、基質(zhì)降解與移動(dòng)，抑制其中任何一個(gè)過程理論上均可抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，以腫瘤血管生成為靶點(diǎn)，開發(fā)血管生成抑制劑在抗腫瘤研究中是一個(gè)新的十分活躍的研究領(lǐng)域。目前大約發(fā)現(xiàn)了300多種具有血管生成抑制活性的化合物其中超過30個(gè)進(jìn)入臨床Ⅰ到Ⅲ期研究，但是目前臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明很多藥物在抑制血管生成的同時(shí)帶來了不可抵抗的毒副作用，因此人們逐漸將目光轉(zhuǎn)向了天

2、然藥物的研究。祖國(guó)醫(yī)學(xué)中中藥具有取材簡(jiǎn)便，毒副作用少的特點(diǎn)，因此以天然藥物為研究對(duì)象，來探討和研究新型的抗腫瘤藥物已逐漸成為當(dāng)今熱點(diǎn)。本試驗(yàn)旨在研究并證明傳統(tǒng)中藥半枝蓮活性成分的抗腫瘤活性，繼之課題組的前期研究結(jié)果，從血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶-2以及整合素αγβ 3等角度探討半枝蓮活性成分的抗腫瘤作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物奠定理論基礎(chǔ)。 我們采用系統(tǒng)溶劑分離法、硅膠柱層析法等方法，獲得半枝蓮不同極性的提取

3、物以MTT比色試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)為手段，從中篩選出抑制內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的成分。采用免疫熒光術(shù)、ELISA等方法，進(jìn)一步研究其抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.半枝蓮黃酮類化合物的提取與分離：硅膠柱層析法以氯仿．甲醇混合溶劑梯度洗脫(10:0； 100:1； 100:4；100:8；100:20；100:50；0:1)，收集洗脫液，由硅膠薄層(TLC)檢識(shí)，合并相同流份，共得7

4、個(gè)極性部位(A、B、C、D、E、F、G)。 2.半枝蓮抑制內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞增殖有效成分的篩選：各部位經(jīng)MTT法檢測(cè)活性，最后得活性強(qiáng)的部位。活性最強(qiáng)的半枝蓮黃酮類化合物不同濃度(20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)與空白對(duì)照組比較能有效抑制ECV-304細(xì)胞系、SGC-790l細(xì)胞系以及B16-BL6細(xì)胞系的增殖。 3.半枝蓮黃酮類化合物能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡：取30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、24

5、0μg/ml四個(gè)濃度梯度，隨濃度增加細(xì)胞凋亡率也增加，但30μg/ml組與空白組比較沒有顯著差異，當(dāng)濃度達(dá)到120μg/ml時(shí)，胃癌細(xì)胞凋亡增加，與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)。 4.半枝蓮黃酮類化合物能抑制：ECV-304細(xì)胞系和B16BL6細(xì)胞系對(duì)基底膜黏附能力：作用B16BL6細(xì)胞60min后高劑量組(40μg/ml)與對(duì)照組之間統(tǒng)計(jì)有顯著差異(p<0.01)，作用120min后中高劑量組(20μg/ml、40

6、μg/ml)與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)，各劑量組從低到高其粘附率呈遞減趨勢(shì)；作用后的ECV-304對(duì)基底膜的黏附率在60min與對(duì)照組比較無(wú)差異，作用120min后濃度達(dá)到40μg/ml時(shí)其對(duì)基底膜的黏附率與對(duì)照組比較有差異(P<0.01)。 5.半枝蓮黃酮類化合物能抑制ECV-304細(xì)胞系與B16-BL6細(xì)胞系之間黏附能力：半枝蓮黃酮類化合物作用120min后B16-BL6細(xì)胞系對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力顯著下降，

7、與空白組比較有顯著差異(P<0.01)。 6.半枝蓮黃酮類化合物能抑制SGC-7901細(xì)胞VEGF、MMP-2的表達(dá)：同一時(shí)間段與空白對(duì)照組相比，半枝蓮黃酮類化合物各濃度作用細(xì)胞24、48h后均能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的VEGF表達(dá)，具有顯著差異(p<0.01)。半枝蓮黃酮類化合物作用細(xì)胞48h后中、高濃度組(40gg/ml、80μg/ml)能抑制腫瘤細(xì)胞MMP-2的表達(dá)，與對(duì)照組比較有顯著差異(p<0.01)。同一濃度體系，24h與

8、48h相比在中、高濃度時(shí)對(duì)VEGF表達(dá)影響具有差異性(P<0.01)，高濃度時(shí)對(duì)MMP-2表達(dá)影響具有差異性(P<0.01)，其他濃度相比沒有顯著差異。 結(jié)論：半枝蓮黃酮類化合物C在體外具有抑制VEGF及MMP-2表達(dá)的作用，并抑制內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞對(duì)基底膜的黏附能力，其機(jī)理可能通過抑制腫瘤細(xì)胞黏附分子和其他促血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制內(nèi)皮細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖從而阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移