重組人CD22單克隆抗體SM03治療CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤實驗和臨床研究.pdf

1、非霍奇金淋巴瘤(non—Hodgkin's lymphoma,NHL)是起源于淋巴細胞不同分化階段的一組異質性(heterogeneity)惡性腫瘤。在過去的30年里,非霍奇金淋巴瘤在世界范圍內的發(fā)病率幾乎增長了一倍,使之成為繼肺癌和黑素瘤之后第3個增長最快的癌癥。在美國,2008年新診斷NHL病例估計有66120例,已成為第5位的常見惡性腫瘤。NHL大多為B細胞性,在美國,B細胞HLN的比例約80～85％,我的T細胞NHL的比例較西方

2、為高,約為30％。
　　 化療是非霍奇金淋巴瘤主要的傳統(tǒng)治療方法,由于受細胞毒藥物副作用的限制,很難再進一步提高化療藥物的劑量,另一方面,有研究也表明,傳統(tǒng)細胞毒化療藥物進一步提高非霍奇金淋巴瘤臨床療效的空間也十分有限了。靶向免疫治療提高了NHL的治療效果。研究表明美羅華聯(lián)合CHOP方案治療老年彌漫大B細胞淋巴瘤,治療組和對照相比,5年的DFS提高21％(66％vs45％),5年的總生存提高13％(58％vs43％)。
　

3、　 重組人CD22單克隆抗體(代碼:SM03)是由深圳龍瑞藥業(yè)有限公司開發(fā)。SM03是一個人-鼠嵌合化IgG1單克隆抗體,由鼠源抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)(VariableRegions)、和人源抗體kappa輕鏈和gamma-1重鏈恒定區(qū)(Kappa/IgG1 ConstantRegions)構成。重組人CD22單克隆抗體分子量為148 kD,能特異的識別并結合正常的和惡性B淋巴細胞表膜抗原CD22。SM03和惡性B淋巴細胞表膜抗原CD2

4、2結合后,進而通過誘導腫瘤細胞凋亡(apoptosis)、抗體依賴細胞介導的細胞毒(ADCC)等免疫效應機制,殺傷腫瘤細胞。
　　 CD22是一個分子量135-kd的唾液酸糖蛋白,并嚴格局限表達在分化成熟的B-細胞表面。一旦表達為膜蛋白,CD22持續(xù)存在、直至分化成熟為漿細胞,在B-細胞的分化、發(fā)育、成熟過程中起關鍵作用。CD22在淋巴濾泡斗笠區(qū)(mantle)和B細胞生發(fā)中心邊緣區(qū)表達程度高。CD22在B細胞非霍奇金淋巴瘤廣泛

5、表達,其確切功能目前尚不清楚。研究表明其對于B細胞的存活有重要作用。B細胞CD22無表達的鼠,其B細胞凋亡加速,壽命縮短。由于CD22表達嚴格地局限于成熟和癌變的B細胞表面,與CD20分布相似,因此使得CD22成為繼CD20后可用于新藥開發(fā)而令人注目的抗原靶點。
　　 Epratuzumab(依帕珠單抗)是一個特異性抗B淋巴細胞CD22抗原特異性表位的人源化單克隆抗體。Epratuzumab治療非霍奇金淋巴瘤的Ⅰ—Ⅱ期臨床研究已

6、經(jīng)完成,已經(jīng)進入Ⅲ期臨床研究階段。已完成的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗顯示,Epratuzumab起始劑量從120mg/m2到1000mg/m2,每周一次,連用4周給藥,患者耐受良好,少數(shù)在輸注后出現(xiàn)1或2級不良反應,主要是首次輸液時畏寒、寒顫、惡心和低血壓。Epratuzumab在人體血清半衰期較長,為23.9天。在240 mg/m2和360 mg/m2劑量級可以獲得明顯的臨床抗腫瘤療效。對于濾泡型或復發(fā)進展型非霍奇金淋巴瘤,Epratuzuma

7、b治療后均可獲得一定療效,甚至對美羅華治療失敗的患者,Epratuzumab治療后也可獲得療效,對于濾泡型淋巴瘤效果較好。
　　 SM03由深圳龍瑞藥業(yè)有限公司開發(fā),是人一鼠嵌合化IgG1單克隆抗體?？筃HL的鼠源SM03抗體與Epratuzumab一樣,也是特異于CD22抗原的B表位,鼠源SM03經(jīng)過“嵌合化”或“人源化”改建后,應表現(xiàn)與Epratuzumab相似的安全性和臨床療效。
　　 SM03臨床前研究表明,SM

8、03能特異的識別并結合正常的和惡性B淋巴細胞表膜抗原CD22,SM03抗體高度靶向性地與B細胞組織器官——脾、淋巴結和惡性淋巴瘤細胞特異結合,而與其他正常人體組織器官沒有交叉反應。SM03抗體可以誘導獼猴和食蟹猴外周血CD22+B細胞清除效應。臨床前藥代動力學研究顯示體內藥動學符合二房室模型。
　　 本研究分為四部分:第1部分選擇B細胞淋巴瘤細胞株Raji和Ramos細胞株,研究SM03體外對于Raji和Ramos細胞株抑瘤作用

9、,探討PI3K信號傳導凋亡通路在SM03抗B細胞淋巴瘤中的作用；第2部分采用免疫組化方法檢測非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織CD22抗原的表達情況,初步探討CD22抗原在非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織的表達和臨床病理特征的關系,篩選SM03靶向治療的患者；第3部分研究重組人CD22單克隆抗體SM03在中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者的劑量安全性和耐受性,為確定后續(xù)Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗用藥劑量和頻次奠定基礎,并初步研究中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴

10、瘤患者對SM03的初步的抗腫瘤療效反應；第4部分采用競爭ELISA法研究SM03在中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者的的藥代動力學行為,并計算藥代動力學參數(shù),考察重組SM03藥代動力學參數(shù)和中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者對SM03的療效反應和毒性的關系,為Ⅱ期臨床試驗設計合理給藥方案和臨床安全有效用藥提供理論依據(jù)。
　　 第1部分重組人CD22單抗隆抗體SM03對人B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞株的體外抑瘤作用以及抑瘤

11、機制的實驗研究目的:研究重組人CD22單克隆抗體(SM03)對B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞株的體外生長抑制作用,探討PI3K信號傳導凋亡通路在SM03抗人B細胞淋巴瘤中的作用。
　　 方法:選擇B細胞淋巴瘤細胞株Raji和Ramos細胞株,流式細胞儀檢測Raji和Ramos細胞的CD22抗原表達量,流式細胞儀檢測細胞的凋亡率和周期分布；采用CCK-8法測定SM03對Ramos和Raji細胞生長抑制作用；并采用Western blot

12、法檢測Raji和Ramos細胞株Bcl-2、Bax、Bcl-xL、Mcl-1、Akt及p-Akt蛋白的表達情況。
　　 結果:SM03對Raji和Ramos細胞株的體外抑瘤作用均較弱。SM03在0—400μg/ml濃度范圍內對Raji細胞的抑制率為26.18～31.84％,平均值為30.64±3.26％,SM03在0—400μg/ml濃度范圍內對Ramos細胞的抑制率為2.67～22.47％,平均值為11.93±9.96％。

13、r>　　 SM03在25、50、100μg/ml的劑量下并不引起Ramos細胞的凋亡,亞G1期細胞所占的比例分別為1.6％、2.0％、1.8％和2.2％；SM03在25、50、100μg/ml的劑量能引起Raji細胞的凋亡,亞G1期細胞所占的比例分別為4.6％、6.9％、13.7％和17.6％；相同條件下均未能對兩種細胞的周期分布產(chǎn)生影響。
　　 在Ramos細胞中未檢測到Bcl-2蛋白的表達；p—Akt蛋白在兩株細胞中均未檢

14、測到表達；SM03未能對Bcl-2家族蛋白(Bax、Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-1蛋白)在Ramos和Raji細胞的表達產(chǎn)生影響；Akt蛋白在Raji細胞中觀察到隨SM03劑量的增加其表達量逐漸減少；Akt蛋白在Ramos細胞中未檢測明顯的變化。
　　 結論:SM03體外對B細胞淋巴瘤細胞株的抑瘤作用較弱。在25、50、100μg/ml的劑量能引起Raji細胞的凋亡,并能抑制Akt蛋白的表達,但對p-Akt并不產(chǎn)生影響,對

15、Bcl-2家族蛋白表達不產(chǎn)生影響。SM03不通過PI3K/Akt信號通路和Bcl-2家族蛋白凋亡途徑誘導Raji細胞的凋亡。
　　 第2部分 B細胞非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織CD22抗原表達檢測及臨床意義目的:檢測CD22抗原在非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織中的表達,初步探討CD22抗原在非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織的表達和臨床病理特征的關系,篩選SM03靶向治療的患者。
　　 方法:采用免疫組化方法檢測B細胞非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織CD2

16、2抗原的表達,初步探討腫瘤組織CD22抗原表達和臨床病理特征等的關系。
　　 結果:CD22抗原可以采用免疫組化方法在B細胞非霍奇金淋巴瘤腫瘤組織中檢測出,陽性表達的棕黃色或棕褐色顆粒主要見于細胞漿和細胞膜。全組21例,陰性0例,弱陽性(+)11例,中等陽性(++)7例,強陽性(+++)3例,高表達10例,低表達11例,陽性率100.00％(21/21),中等陽性率33.33％(7/21),強陽性率14.29％(3/21)。

17、r>　　 全組8例彌漫大B細胞淋巴瘤患者,腫瘤組織中CD22抗原呈弱陽性表達2例,中等陽性表達4例,強陽性表達2例；8例濾泡性淋巴瘤患者,弱陽性表達7例,中等陽性表達1例；2例濾泡轉彌漫的非霍奇金淋巴瘤患者,1例為中等陽性的表達,1例為強陽性表達,2例慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤患者,腫瘤組織CD22表達均為弱陽性。1例伯基特淋巴瘤患者,腫瘤組織CD22抗原呈中等陽性表達。
　　 全組21例患者,20例可評價療效。4例

18、臨床療效評價進展的患者,腫瘤組織中CD22高表達3例,低表達1例。1例觀察期結束后續(xù)隨訪臨床療效獲得PR的患者,腫瘤組織中CD22抗原為弱陽性表達。
　　 結論:CD22抗原在B細胞非霍奇金淋巴瘤中廣泛表達,可以采用免疫組化的方法檢測出,檢測方法簡單、易行,可用于臨床作為B細胞非霍奇金淋巴瘤免疫標記檢測,CD22表達和臨床病理特征的關系需進一步研究。
　　 第3部分重組人CD22單克隆抗體SM03治療CD22陽性B細胞非

19、霍奇金淋巴瘤Ⅰ期臨床試驗的耐受性研究目的:研究重組人CD22單克隆抗體SM03在中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者的劑量安全性和耐受性,為確定后續(xù)Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗用藥劑量和頻次奠定基礎;初步考察SM03對中國B細胞非霍奇金淋巴瘤患者的初步療效反應以及免疫學影響。
　　 方法:SM03從低劑量60mg/m2開始,按照60mg/m2,120 mg/m2,240 mg/m2,360 mg/m2,480 mg/m2劑量級,劑量循序

20、漸進,逐步爬升,每個劑量級入組1～6例患者,采用多劑量給藥,SM03加入250ml生理鹽水中,恒速滴注3小時,每周給藥1次,連續(xù)4周給藥,考察SM03的臨床安全性和耐受性。SM03治療第28天,采用CT或MR檢查評價SM03治療效果。
　　 結果:從2007年4月至2008年11月,21例在中山大學腫瘤防治中心治療的CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者入組。21例患者中,男10例,女11例,年齡范圍24～67歲,中位年齡52歲,

21、體力情況0～2級。全組21例患者,共進行87次SM03給藥,其中360mg/m2劑量組1例患者進行2個療程共8次SM03給藥,240mg/m2劑量組1例患者因發(fā)生SAE只進行3次SM03治療。入組21例患者,均出現(xiàn)不同程度的不良事件。藥物相關的不良反應輕微,多為1～2級。常見不良事件包括:發(fā)熱、疲勞、胃納下降、皮疹、失眠癥、注射局部皮膚改變、腫瘤部位疼痛、肝腎功能損害、白細胞降低、血紅蛋白下降、淋巴細胞減少、蛋白尿、尿潛血、尿白細胞增多

22、、部分凝血活酶時間延長和心肌勞損等。其中60mg/m2劑量組1例完成4次給藥后,觀察期發(fā)生咽喉部大出血(與試驗藥物可能無關,己按照嚴重不良事件報告),240mg/m2劑量組1例3次給藥后,發(fā)生上消化道大出血(與試驗藥物可能無關,已按照嚴重不良事件報告),給予退組,120mg/m2劑量組1例4次給藥后腫瘤明顯進展,腫瘤致疼痛非常明顯,給予退出觀察,進行化療處理。360mg/m2劑量組出現(xiàn)1例劑量限制性毒性,表現(xiàn)為4級中性粒細胞減少,480

23、mg/m2劑量級患者,50％(3/6)出現(xiàn)局部注藥部位皮膚改變。沒有出現(xiàn)MTD。21例入組患者中,按照1998年國際工作組淋巴瘤療效評價標準,20例可評價療效,4患者腫瘤進展,16例SD。進展的4例患者,病理類型均為彌漫大B,療效SD的患者,多數(shù)病例,目標病灶雙徑乘積之和(SPD)治療后稍有減小,病理類型為濾泡型淋巴瘤的患者,療效稍好,1例濾泡型淋巴瘤在SM03試驗方案完成后的隨訪中,腫瘤明顯減小,療效達PR。360mg/m2和480m

24、g/m2劑量組SM03治療后SPD縮小患者的比例較高。
　　 結論:SM03耐受性研究表明,SM03在中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者,安全性和耐受性良好；初步顯示了SM03對中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者有一定的抗腫瘤活性,有一定的清除B淋巴細胞的作用,對細胞和體液免疫沒有明顯影響；推薦360mg/m2和480mg/m2作為進一步研究研究劑量。
　　 第4部分重組人CD22單克隆抗體SM03治療CD2

25、2陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤Ⅰ期臨床試驗的藥代動力學研究目的:考察重組人CD22單克隆抗體SM03在中國CD22陽性的B細胞非霍奇金淋巴瘤患者體內的藥代動力學行為。為Ⅱ期臨床試驗設計合理給藥方案和臨床安全有效用藥提供理論依據(jù)。
　　 方法:20例中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者,爬坡依次進入60mg/m2,120 mg/m2,240 mg/m2,360 mg/m2,480 mg/m25個SM03劑量級,采用競爭性ELISA

26、法檢測的SM03血漿藥物濃度,并計算SM03藥代動力學參數(shù),描述SM03在中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤的藥代動力學行為。
　　 結果:從2007年4月至2008年11月,20例在中山大學腫瘤防治中心治療的CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者入組。20例患者中,女性患者10例,男性患者10例,年齡范圍24～62歲,中位年齡52歲,均值±標準差:52±9.80歲,身高范圍:146.5～174.5cm,均值±標準差:160.7

27、5±8.60cm；體重范圍:37.5～77 kg,均值±標準差:56.95±11.06 kg；體表面積:1.25～1.89 m2,均值±標準差:1.60±0.18 m2；體重指數(shù):16.88～27.06 kg/m2,均值±標準差:21.88±3.11kg/m2。ELISA法滿足SM03藥代動力學研究的要求。SM03溶液的標準曲線四參數(shù)方程為y=POWER(x,1/-1.1134)*24.8812,兩者的斜率、截距具有很好的相關性；批內變

28、異系數(shù)CV:5.5～9.6％,批間變異系數(shù)CV:8.1～11.1％,均小于15％,方法的精密度符合藥代動力學方法學要求；樣本稀釋后測定方法穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,準確度為111.2±0.68％,變異系數(shù)CV:為3.57％;本試驗中樣品解凍三次后保持穩(wěn)定性。
　　 對劑各量級患者在各個檢測點(0、1、2、3、3.5、5、11、27、51、75、123、147h)血清中SM03濃度,血清SM03濃度-時間曲線表現(xiàn)為雙指數(shù)曲線,滴注后血清SM

29、03濃度開始迅速升高,給藥結束后(3小時)左右,血漿SM03達最高濃度,后開始緩慢下降,下降到接近前一次給藥的低點附近,每次給藥的基線抬高不太明顯。
　　 20例各個劑量級中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者,SM03的主要藥物代謝動力學參數(shù)(Cmax、K、T1/2、Vd、CL、MRT、AUC0-∞、AUC0—t、Vss等)總結分別見下表。
　　 結論:采用競爭ELISA法研究SM03在B細胞非霍奇金淋巴瘤患者的的藥

30、代動力學行為,所建立的方法學符合藥代動力學測定的規(guī)定要求。
　　 重組人CD22單克隆抗體SM03滴注入中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者體內后,血清中游離SM03濃度-時間曲線表現(xiàn)為雙指數(shù)曲線,滴注結束濃度最高,隨著劑量增加Cmax增加,個體間變異較大。
　　 SM03不同劑量級,血清中游離抗體SM03在中國CD22陽性B細胞非霍奇金淋巴瘤患者中的藥代動力學參數(shù)分別為:
　　 60 mg/m2:Cmax:

31、36.12μg/mL,t1/2:63 h,AUC0-t:2075.163μg/L·h,AUC0-oo:2556.288μg/L·h,MRT0-∞:70.89 h,CL:0.023472 L/h·m2,Vd:2.133776L/m2,Vss:1.6640453 L120 mg/m2:Cmx:(40.77±9.57)μg/mL,t1/2:(196.48±60.1)h,AUC0-t:(112139.9+108390.2)μg/L·h,AUC0

32、-oo:(399554+317301.5)μg/L·h,MRT0-∞:(111.02±7.34)h,CL:(0.018138±0.003136)L/h·m2,Vd:(5.006544±0.683462)L/m2,Vss:(2.002148±0.214966)L240 mg/m2:Cmax:(126.81±23.34)μg/mL,t1/2:(143.36±23.46)h,AUC0-t:(632438.5±218351.9)μg/L·h,A

33、UC0-∞:(2139238±956755.1)μg/L·h,MRT0-∞:(103.55+6.57)h,CL:(0.013341±0.004942)L/h·m2,Vd:(2.676217±0.846733)L/m2,Vss:(1.361334±0.453195)L360 mg/m2:Cmax:(196.03±30.98)μg/mL,t1/2:(194.83±110.48)h,AUC0-t:(1066470±137764.7)μg/L·

34、h,AUC0-∞:(4670989±2652243)μg/L·h,MRT0-∞:(109.29±11.22)h,CL:(0.009825±0.003185)L/h·m2,Vd:(2.38036±0.379625)L/m2,Vss:(1.045803±0.260127)L480 mg/m2:Cmax:(525.81±102.39)μg/mL,t1/2:(324.01+274.41)h,AUC0-t:(3791400±798343)μg/L

35、·h,AUC0-∞:(23185478±25102489)μg/L·h,MRT0-∞:(116.08±18.29)h,CL:(0.005094±0.003653)L/h·m2,Vd:(1.325607±0.268666)L/m2,Vss:(0.539424±0.336782)L隨著SM03劑量的增加,血清中SM03的AUC呈線性增加,在60mg/m2～360mg/m2劑量范圍,AUC(0-t)隨劑量呈線性增加；但在480mg/m2劑量組