脂質(zhì)體包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的非特異性聚集與鳥嘌呤含量及啟動子位置關(guān)系的動物實驗研究.pdf

1、目的:制備2種鳥嘌呤(Guanine G)含量及2種離啟動子位置遠近不同的脂質(zhì)體包裹99Tcm-HYNIC(聯(lián)肼尼克酰胺)-survivin(生存素)ASODN(antisense oligodeoxynucleotide,反義寡脫氧核苷酸),用制備好的4種反義寡脫氧核苷酸顯像探針對荷人肝癌(SMMC-7721)裸鼠進行顯像及體內(nèi)生物學(xué)分布研究,分析ASODN與啟動子相對位置及其G含量對非特異性聚集的影響,以尋找最佳反義顯像堿基序列,提

2、高反義顯像質(zhì)量。
　　 方法:
　　 1：腫瘤模型制備:瘤細胞接種:SMMC-7721肝癌細胞經(jīng)細胞傳代培養(yǎng)后,取處于對數(shù)生長期的細胞0.2ml(含細胞數(shù)約為0.7×107個),在無菌條件下接種于健康BALB/C裸小鼠右髂窩皮下,并在SPF(specific pathogenfree,無特異病原體)環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)約6～8周后,待腫瘤生長至0.8～1.0cm時進行實驗分組。
　　 2：脂質(zhì)體包裹99Tcm-HYNIC

3、-survivinASODN的制備:制備兩種G含量相同而離啟動子遠、近不同10個堿基單鏈ASODN和兩種G含量不同而離啟動子位置相近16個堿基單鏈ASODN,前者兩端均3個磷酸基硫代修飾,后者兩端均5個磷酸基硫代修飾,四種ASODN均5'-末端氨基修飾,偶聯(lián)HYNIC后用99Tcm標(biāo)記,然后用Cellufine Mini-Column(內(nèi)裝有Chisso纖維素基凝膠填料CellufineGH-25,分子量＞3kD的物質(zhì)可被濾出)純化經(jīng)Z

4、D-600099Tcm分析儀,測定收集放射峰管,然后脂質(zhì)體包裹備用。
　　 3：脂質(zhì)體包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的質(zhì)量鑒定:用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)及快速硅膠紙層析法和聚酰胺凝膠薄膜法測定標(biāo)記物即刻標(biāo)記率及放化純。并測定標(biāo)記物分別與生理鹽水及人新鮮血清37℃保溫6h后的標(biāo)記率,評價標(biāo)記物的穩(wěn)定性。
　　 4：分組

5、顯像及生物學(xué)分布:將20只荷瘤小鼠隨機分為四組,分別注射不同的顯像劑A1、A2、A'1、A'2,每組5只,分別經(jīng)尾靜脈注入相應(yīng)的脂質(zhì)體包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN,每只分別注射含37MBq(1mCi)/0.2ml顯像劑,進行顯像和體內(nèi)生物分布研究。注射后2h和4h仰臥在針孔型準(zhǔn)直器下用SPECT(single photon emission computedtomography,單光子發(fā)射型計算機體層攝影)儀進

6、行靜態(tài)核素顯像,在采集的平面圖像上,以相同大小感興趣區(qū)(ROI,region of interest)獲取腫瘤部位(T,tumor)和對側(cè)肢體相應(yīng)部位的放射性計數(shù)(NT,non-tumor),計算2h和4h時NT/T(non-tumor to tumor)放射性比值。4h顯像結(jié)束后立即眼球取血,脫頸處死,迅速分離其腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、骨、對側(cè)肢體肌肉等臟器、組織,生理鹽水洗滌后粘干、稱重,置于試管中用γ井型探測儀測量各器

7、官或組織的放射性計數(shù)及同時刻標(biāo)準(zhǔn)源的放射性計數(shù),計算每克組織中放射性計數(shù)占標(biāo)準(zhǔn)源總放射性計數(shù)的比值(％ID/g),計算4h時肌肉組織與腫瘤組織的％ID/g比值(muscle to tumor,M/T),即NT/T比值,并進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 5：病理學(xué)檢查:各組中隨機選取荷人肝癌(SMMC-7721)裸鼠瘤體的切塊,用4％多聚甲醛固定,48小時后,石蠟包埋,行常規(guī)HE染色。
　　 結(jié)果:
　　 1：裸鼠移植瘤模

8、型的觀察與鑒定:
　　 20只裸鼠均接種成功,成瘤率100％。肉眼觀察可見腫塊呈肉紅色,結(jié)節(jié)狀,表面光滑,質(zhì)硬,切面呈灰白色。HE染色細胞著色不均勻,呈上皮樣狀態(tài),卵圓形,多邊形,星形等不規(guī)則形態(tài),核分裂像多見,核漿比例失調(diào)倒置,核異型性明顯,符合腫瘤特點。
　　 2：脂質(zhì)體包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的質(zhì)量鑒定結(jié)果:
　　 HPLC檢測99Tcm-HYNIC-survivinASODN

9、呈單峰,保留時間約為18min,與survivinASODN紫外峰保留時間相吻合。結(jié)合快速硅膠紙層析法及聚丙酰胺凝膠薄膜層析法綜合測得的99Tcm-HYNIC-survivinASODN的即刻標(biāo)記率為70％±0.69％(n=5)。經(jīng)Cellufine Mini-Column純化后放射性化學(xué)純度約為95％±1.29％(n=5)。與生理鹽水及人新鮮血清37℃保溫6h后測定標(biāo)記率分別約為66％、65％,放化純?yōu)?3％、90％左右,二者變化不明

10、顯,說明此標(biāo)記物血清蛋白結(jié)合率低,穩(wěn)定性好。
　　 3：顯像及生物學(xué)分布結(jié)果:
　　 顯像情況:注射顯像劑2h時荷瘤小鼠腹部放射性核素濃聚明顯,肝臟和雙腎顯影清晰,胸部放射性核素濃聚稍淡,四肢和頭部核素分布稀疏,右髂窩腫瘤部位顯影清晰,隨著時間延長,周圍組織本底逐漸降低,右髂窩腫瘤部位核素逐漸增濃,4h時達高峰。
　　 生物學(xué)分布:四種99Tcm-HYNIC-survivinASODN都是肝、腎％ID/g值較高,

11、說明都是通過肝臟代謝,腎臟排泄,因此腹部本底較高。
　　 四種顯像劑顯像及分布結(jié)果比較:NT/T值A(chǔ)1、A2分別為0.243±0.005和0.405±0.007(2h);0.204±0.004和0.267±0.007(4h);A'1、A'2分別為0.256±0.004和0.479±0.015(2h);0.227±0.004 and0.360±0.013(4h)。體內(nèi)分布:A1、A2、A'1、A'2 NT/T分別為0.173±0.

12、035,0.315±0.059,0.293±0.049,0.430±0.021(4h)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后得出,A1、A2在荷瘤鼠中顯像的NT/T值比較在2h和4h均有顯著性差異(2h時t=40.425,p=0.000＜0.01;4h時t=16.760,p=0.000＜0.01);A'1、A'2在荷瘤鼠中顯像的NT/T值比較在2h和4h也均有顯著性差異(2h時t=31.194,p=0.000＜0.01;4h時t=22.356,p=0.000

13、＜0.01)。A1、A2在荷瘤鼠中4h生物分布的NT/T值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.622,p=0.022＜0.05);A'1、A'2在荷瘤鼠中4h生物分布的NT/T值比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.403,p=0.012＜0.05.)。
　　 結(jié)論:
　　 研究表明:G含量相同,離啟動子位置較近的反義顯像堿基序列,非特異性聚集率較低,顯像質(zhì)量較好;啟動子位置相近,G含量低的反義顯像堿基序列,非特異性聚集率較低,顯像