紅茶菌優(yōu)勢(shì)微生物的分離、鑒定及抗菌機(jī)理的研究.pdf

1、紅茶菌發(fā)酵液是一種由酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等多種微生物發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)酸性茶飲料。其發(fā)酵液中含有多種營養(yǎng)因子，包括茶葉中一些營養(yǎng)成分、活的微生物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物。紅茶菌來源不同，微生物種類差異很大。本論文對(duì)紅茶菌優(yōu)勢(shì)微生物的分離鑒定、抗菌微生物的篩選、發(fā)酵液中蛋白質(zhì)分析條件優(yōu)化，培養(yǎng)過程中菌相及發(fā)酵液中的物質(zhì)變化及其抑菌機(jī)理進(jìn)行了研究。 主要研究結(jié)果如下： 1. 從紅茶菌中分離了3類共12株微生物從紅茶菌中分離和鑒定的

2、微生物有：6株醋酸菌包括2株液化醋桿菌(A.liquefaciens)，1株醋化醋桿菌(A.aceti)，2株重氮營養(yǎng)醋桿菌(A.diazot-rophicus)，1株甲醇醋桿菌(A.metha nolica)，4株酵母菌包括克魯絲假絲酵母(Candida Krusei)，漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces prombe Linder)，釀酒酵母(Sacch

3、aromyces cerivisiae)，乳酸菌LA(Lactobacillus A)及乳酸菌LP(Lactobacillus P)。其中重氮營養(yǎng)醋桿菌(A.diazot-rophicus)、甲醇醋桿菌(A.metha nolica)為首次發(fā)現(xiàn)。 2.培養(yǎng)過程中菌相處于動(dòng)態(tài)變化中在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，紅茶菌發(fā)酵液每毫升的微生物數(shù)量比每克菌膜中多。培養(yǎng)至第6d，發(fā)酵液中的醋酸菌的數(shù)量比菌膜中的數(shù)量高出7倍；酵母菌的數(shù)量高2倍。在培養(yǎng)過

4、程中醋酸菌和酵母菌的生長曲線相似。發(fā)酵液中的乳酸菌數(shù)量比酵母菌和醋酸菌低，其對(duì)數(shù)生長期在培養(yǎng)后的第6d～8d，比醋酸菌、酵母菌慢得多。培養(yǎng)時(shí)間長短不同，菌的數(shù)量存在差異。 從紅茶菌中分離出的醋酸菌和酵母菌分別培養(yǎng)，發(fā)酵液中的數(shù)量變化具有典型的微生物生長曲線，但醋酸菌和酵母菌混合培養(yǎng)，二者的發(fā)酵液中的數(shù)量變化趨勢(shì)無顯著差異，但其發(fā)酵液中的微生物數(shù)量高于紅茶菌菌膜培養(yǎng)的數(shù)量，pH值高于紅茶菌發(fā)酵液。 3.紅茶菌成膜及發(fā)酵液中

5、的物質(zhì)變化紅茶菌培養(yǎng)成膜與糖代謝密切相關(guān)。培養(yǎng)液糖含量是影響成膜的主要因素，添加適當(dāng)濃度酒精、酵母膏和蛋白胨能明顯提高菌膜的生成量；培養(yǎng)液的表面積增大，有利于膜的形成；僅以酒精作為碳源不成膜。培養(yǎng)液pH高低與膜生成量呈負(fù)相關(guān)。紅茶菌培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液中的可溶性固形物含量變化基本呈直線下降趨勢(shì)，pH值在發(fā)酵前期急劇下降，中后期保持穩(wěn)定。培養(yǎng)12d，發(fā)酵液中游離氨基酸總量從培養(yǎng)液的70.494μg/mL降到27.439μg/mL。酵母菌Y3

6、、醋酸菌C64和乳酸菌LA和LP混合培養(yǎng)，形成了培養(yǎng)液沒有的氨基酸。 在酵母菌Y3、醋酸菌C64、乳酸菌LA、LP、紅茶菌分別培養(yǎng)及Y3、C64、LA、LP混合培養(yǎng)中，其發(fā)酸液中兒茶素的總量下降。但在酵母菌Y3、醋酸菌C64分別培養(yǎng)中，發(fā)酵液中的EGC、EC含量大幅度增加，其他兒茶素含量都下降，而ECG降至培養(yǎng)液的20％以下。在乳酸菌LA、LP分別培養(yǎng)中，發(fā)酵液中的EGC、EC含量大幅度減少，DL-C、GCG含量大幅度增加。紅茶

7、菌及酵母菌Y3、醋酸菌C64和乳酸菌LA和LP混合培養(yǎng)中，而DL-C、EC含量增加。結(jié)果表明，酵母菌、醋酸菌具有降解酯型兒茶素的作用，乳酸菌有改變兒茶素空間結(jié)構(gòu)的作用。 4.抗菌優(yōu)勢(shì)微生物的篩選除去乙酸的醋酸菌發(fā)酵液，有促進(jìn)指示菌生長的作用，選擇出了促進(jìn)作用較弱的C64菌株。酵母菌、乳酸菌均具有一定的抑制指示菌的能力，醋酸菌C64和Y3混合培養(yǎng)抑菌效果最強(qiáng)，選擇出了具有較強(qiáng)抑菌能力的酵母菌Y3和乳酸菌LA和LP。因此，確定了抗菌

8、能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)微生物粟酒裂殖酵母Y3、醋酸菌C64、乳酸菌LA和乳酸菌LP組合。 5.發(fā)酵液蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳條件優(yōu)化對(duì)紅茶菌發(fā)酵液蛋白質(zhì)的分析方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.0，加入0.2％不溶性PVP，振蕩20min，4000r/min離心15min， MD34透析袋透析3d，冷凍濃縮獲得的蛋白質(zhì)電泳樣品液；11％分離膠，5％濃縮膠電泳，能獲得清晰的蛋白質(zhì)譜帶。 6.發(fā)酵液抗菌是酸性物質(zhì)、抗菌蛋白、

9、茶多酚等協(xié)同作用的結(jié)果采用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌作為指示菌，分別對(duì)不同濃度的茶葉水浸出物，紅茶菌發(fā)酵液的pH值，發(fā)酵液的透析液，透析液分別經(jīng)胰蛋白酶、過氧化氫酶、蛋白酶K處理的樣品液的抑菌效果進(jìn)行了研究。1.0％(W/V)茶葉的水浸出物、紅茶菌發(fā)酵液及發(fā)酵液的透析液對(duì)指示菌均有抑菌效果，經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K處理的樣品液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制效果明顯降低，說明紅茶菌發(fā)酵液中存在抑菌蛋白。紅茶菌發(fā)酵液的抗菌作用是由酸性物質(zhì)、抗菌蛋