N-去硫酸肝素對(duì)胃癌細(xì)胞堿性成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)、血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、胃癌是我國常見的消化道腫瘤，而胃癌的轉(zhuǎn)移是造成該病的主要死亡原因，目前對(duì)胃癌的轉(zhuǎn)移缺少有效的治療方法。以往的研究表明，肝素為高度硫酸化蛋白多糖，作為抗凝劑，已被廣泛用于臨床。然而，由于肝素強(qiáng)烈的抗凝活性，限制了它的臨床應(yīng)用，對(duì)肝素進(jìn)行化學(xué)修飾，可降低其抗凝活性，但可增強(qiáng)其抗腫瘤作用。 肝素、非抗凝性肝素和多硫酸化肝素類似物被顯示具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維生長因子結(jié)合到相應(yīng)受體的作用，從而抑制他們的活性。我們研究N-

2、去硫酸肝素對(duì)NODSCID小鼠胃癌轉(zhuǎn)移模型及體外培養(yǎng)的SGC-7901胃癌細(xì)胞的作用，并通過熒光定量PCR及ELISA方法檢測胃癌細(xì)胞bFGF表達(dá)，旨在為胃癌的治療開辟一條新的治療途徑。 第一部分 N-去硫酸肝素對(duì)胃癌堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因表達(dá)和血管形成的影響 目的 研究N-去硫酸肝素對(duì)人胃癌組織原位移植NODSCID小鼠轉(zhuǎn)移模型的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth fac

3、tor，bFGF)基因表達(dá)、血管形成和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。 方法 建立人胃癌組織原位移植NODSCID小鼠胃癌轉(zhuǎn)移模型。移植后一周，20只小鼠隨機(jī)分成兩組，分別靜脈注射生理鹽水(0.9％氯化鈉組)與10mg/Kg N-去硫酸肝素(N-去硫酸肝素組)，每周兩次，共三周。第六周處死動(dòng)物，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織微血管密度表達(dá)，熒光定量PCR檢測腫瘤組織bFGF基因mRNA表達(dá)。 結(jié)果 0.9％氯

4、化鈉溶液組10只小鼠9只有腫瘤轉(zhuǎn)移，N-去硫酸肝素組10只小鼠只有兩只轉(zhuǎn)移，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。未發(fā)現(xiàn)出血等不良反應(yīng)。0.9％氯化鈉溶液組平均微血管密度為9.1±3.4，N-去硫酸肝素組為4.7±1.8，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.617，P<0.05)。熒光定量PCR測定顯示，N-去硫酸肝素組bFGFmRNA(2.60±0.56％)相對(duì)表達(dá)量較0.9％氯化鈉溶液組(30.65±6.84％)低，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

5、義(t=4.08，P<0.01)。 結(jié)論 N-去硫酸肝素通過抑制胃癌組織bFGF基因表達(dá)和血管生成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。N-去硫酸肝素?zé)o明顯出血等不良反應(yīng)。 第二部分 N-去硫酸肝素對(duì)體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞表達(dá)bFGF的影響 目的： 探討N-去硫酸肝素對(duì)體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞bFGF表達(dá)的影響。 方法： 體外培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細(xì)胞，加入含不同濃度N-去硫酸

6、肝素(0.1、1mg/ml，N-去硫酸肝素組)的RPMl1640培養(yǎng)液，并設(shè)對(duì)照(為培養(yǎng)液，對(duì)照組)，每組平行3個(gè)樣本。繼續(xù)培養(yǎng)，分別12h、24h。應(yīng)用雙抗體夾心ABC-ELISA法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測胃癌細(xì)胞堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達(dá)。 結(jié)果： ELISA結(jié)果顯示，對(duì)照組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，bFGF在培養(yǎng)胃癌細(xì)胞的上清液表達(dá)顯著上升(12h對(duì)24h，P<0.05)。與對(duì)照組相比較，0.1、1mg/

7、ml N-去硫酸肝素組培養(yǎng)12、24h，bFGF的表達(dá)下降均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；1mg/m1N-去硫酸肝素作用12h、24h，與0.1mg/ml N-去硫酸肝素相比，bFGF表達(dá)均顯著下降(P<0.05)。0.1mg/ml、1mg/ml N-去硫酸肝素作用24小時(shí)與作用12小時(shí)相比，bFGF表達(dá)均顯著下降(P<0.05)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，N-去硫酸肝素各濃度組胃癌細(xì)胞bFGFmRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.05)。

8、N-去硫酸肝素對(duì)胃癌細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)的抑制作用為1mg/ml>0.1mg/ml(P<0.05)，存在劑量依賴性。在同一濃度，予N-去硫酸肝素作用24h，胃癌細(xì)胞bFGF mRNA表達(dá)較12h顯著降低(P<0.05，1mg/ml N-去硫酸肝素組)，提示N-去硫酸肝素對(duì)胃癌細(xì)胞bFGFmRNA表達(dá)的抑制作用具有時(shí)間依賴性。 結(jié)論： N-去硫酸肝素可以顯著抑制體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞bFGF的表達(dá)，且具有時(shí)間、劑量依賴性