毛細管電泳分析肺癌基因及相關(guān)蛋白質(zhì)的方法學(xué)研究.pdf

1、腫瘤是多因素作用下，多階段演化而成。隨著各種檢測技術(shù)的發(fā)展及學(xué)科之間的滲透，一些腫瘤生物指標從最初的分子生物學(xué)檢測發(fā)展到化學(xué)檢測。本論文以分析化學(xué)的檢測方法毛細管電泳(CE)對肺癌DNA，蛋白質(zhì)進行分析，并對聚環(huán)氧乙烷(PEO)中添加納米材料金納米粒子(GNPs)后的新型篩分介質(zhì)進行研究。
　　 第一部分從DNA角度以CE、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)結(jié)合經(jīng)典突變點分析方法：單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和限制性片段長度多態(tài)性(R

2、FLP)對肺癌及癌旁正常組織p53基因第七外顯子突變情況進行檢測，從上樣量、時間、檢測限和檢出率四個方面進行比較。檢出率由高到低分別為：CE-SSCP＞PAGE-SSCP＞CE-RFLP＞PAGE-RFLP。CE-SSCP可作為大規(guī)模肺癌早期診斷DNA指標簡便可靠的方法。
　　 第二部分首先建立無膠篩分毛細管電泳-激光誘導(dǎo)熒光(NGS-CE-LIF)檢測蛋白質(zhì)的方法，改進后對提取肺癌及癌旁正常組織蛋白質(zhì)混合物(變性/活性)差異進

3、行檢測。該法可對6.5～200kDa范圍蛋白質(zhì)進行分離，具有篩分介質(zhì)濃度調(diào)節(jié)簡便、分離效果好、時間短等優(yōu)點，理論塔板數(shù)(N)均值為9.12×104/m，檢出限為2.8×10-4 mg/ml。肺癌組織與正常組織相比有較明顯蛋白質(zhì)種類及表達量差異，且主要集中在20～116kDa。常用蛋白質(zhì)分析方法：變性 SDS-PAGE及活性藍綠溫和膠電泳(BN-PAGE)結(jié)果與NGS-CE-LIF結(jié)果大致相同，并且PAGE檢測不出的蛋白質(zhì)CE-LIF也能

4、檢測出來。
　　 第三部分合成13 nm的GNPs，透射電子顯微鏡(TEM)對GNPs尺寸進行測量，以PEO-GNPs-TBE(Tris-Boric acid-EDTA)作為CE篩分介質(zhì)，考察分離參數(shù)：篩分介質(zhì)濃度，分離電壓，溫度和篩分介質(zhì)pH值對DNA片段分離的影響。用Ogston模型、偏爬行模型解釋相關(guān)實驗現(xiàn)象，對分離機理進行初步研究。結(jié)果表明添加GNPs的這種新型篩分介質(zhì)分離效果好且時間短，適于分離較寬范圍(100～100