灌注性三維動態(tài)細胞接種和培養(yǎng)方法構建組織工程骨的實驗研究.pdf

1、骨缺損的修復和重建是骨科臨床面臨的問題之一。自體骨是骨移植的金標準，但其來源有限且易引發(fā)供區(qū)并發(fā)癥；同種異體骨和異種骨也可用于治療骨缺損，但存在免疫排斥反應和病毒傳播等潛在危險。利用組織工程技術將成骨性種子細胞與多孔支架材料復合后體外構建組織工程骨為骨缺損的臨床治療提供了新途徑。但是，傳統(tǒng)的靜態(tài)細胞接種和培養(yǎng)方法存在細胞接種率低和分布均勻性差、支架內(nèi)氣體交換及營養(yǎng)供應不足等缺陷，降低了組織工程骨的成骨活性。本研究利用自行設計的灌注式生物

2、反應器進行成骨細胞的灌注性三維動態(tài)接種和培養(yǎng)，以提高細胞的接種率和分布均勻性，促進支架內(nèi)細胞的均勻增殖，增強組織工程骨的成骨活性和對節(jié)段性骨缺損的修復效果。
　　1.成骨細胞在四種多孔支架材料內(nèi)的灌注性三維動態(tài)接種研究
　　目的：檢驗自行設計的灌注式生物反應器用于成骨細胞灌注接種的可行性，對比四種支架材料的細胞接種效果，篩選較優(yōu)的支架材料。方法：選取異體松質骨粒、多孔磷酸三鈣（β-TCP）、明膠海綿、膠原蛋白海綿四種支架材料

3、作為載體，使用自行設計的生物反應器進行人胚胎成骨細胞的灌注接種，以靜態(tài)接種方法為對照，通過細胞活力、活細胞接種率檢測及組織學觀察和計量，比較兩種接種方法和四種支架材料對細胞接種效果的影響。結果：β-TCP和明膠海綿：灌注接種優(yōu)于靜態(tài)接種（P<0.05）；松質骨粒：兩接種組間無統(tǒng)計學差異；膠原蛋白海綿：灌注接種組的細胞活力、活細胞接種率和細胞計數(shù)均低于靜態(tài)接種組（P<0.05），細胞分布均勻性則無顯著差異。灌注接種時，β-TCP、明膠海綿

4、的接種效果優(yōu)于松質骨粒和膠原蛋白海綿，靜態(tài)接種時，膠原蛋白海綿的細胞接種率和細胞計數(shù)最高。結論本研究自行設計的灌注式生物反應器提高了β-TCP和明膠海綿支架內(nèi)成骨細胞的接種效率和分布均勻性。松質骨粒和膠原蛋白海綿不適于灌注接種方法，但膠原蛋白海綿適于靜態(tài)接種方法。
　　2.成骨細胞在多孔β-TCP支架內(nèi)灌注性接種和培養(yǎng)的優(yōu)化研究
　　目的：探討自行設計的灌注式生物反應器用于成骨細胞灌注性接種和培養(yǎng)的可行性，對比不同條件對細胞

5、接種和培養(yǎng)效果的影響，篩選較優(yōu)的細胞接種和培養(yǎng)條件。方法：以多孔β-TCP支架為載體，采用自行設計的灌注式生物反應器進行人胚胎成骨細胞的灌注接種和短期灌注培養(yǎng)，以靜態(tài)接種方法為對照，比較細胞接種時間、細胞懸液密度、灌注接種及灌注培養(yǎng)速率的變化對活細胞接種率和細胞活力的影響。結果：灌注接種12h接種率顯著高于8h和4h（P<0.05），但與24h間無統(tǒng)計學差異；灌注接種細胞懸液密度為2×105/mL時接種率顯著高于1×105/mL（P<0

6、.05），但與5×105/mL相比無統(tǒng)計學意義；灌注速率為1mL/min時灌注接種率最高。灌注培養(yǎng)24h內(nèi)、灌注速率0.5mL/min～2mL/min間細胞活力無顯著變化，但至4mL/min時細胞活力顯著下降（P<0.05）；24h至4d內(nèi)灌注速率2mL/min時細胞活力最高。結論：細胞接種時間、細胞懸液密度、灌注接種和灌注培養(yǎng)速率等因素均影響細胞接種和培養(yǎng)效果；在本研究實驗條件下，細胞灌注性接種和培養(yǎng)的最優(yōu)條件為：接種時間12h～24

7、h，細胞懸液密度2×105/mL～5×105/mL，灌注接種速率1mL/min，灌注培養(yǎng)速率0.5mL/min～2mL/min（24h內(nèi)）和2mL/min（24h～4d）。
　　3.利用灌注性細胞接種/培養(yǎng)系統(tǒng)體外構建組織工程骨
　　目的：利用灌注性細胞接種和培養(yǎng)系統(tǒng)體外構建組織工程骨，以靜態(tài)接種和靜態(tài)培養(yǎng)（SSSC）以及靜態(tài)接種和灌注培養(yǎng)（SSPC）為對照，對比三種方法的構建效果。方法：以多孔β-TCP支架為載體，采用自行

8、設計的生物反應器進行人胚胎成骨細胞的灌注接種和灌注培養(yǎng)（PSPC），以SSSC法和SSPC法為對照，通過葡萄糖日耗量、細胞活力檢測、掃描電鏡（SEM）以及硬組織切片觀察和組織形態(tài)學計量，比較三種方法的細胞增殖和分布情況。結果：三組的葡萄糖日耗量均隨培養(yǎng)時間的延長而增加，SSPC組和PSPC組的葡萄糖日耗量高于SSSC組（P<0.05），培養(yǎng)6d內(nèi)PSPC組的葡萄糖日耗量高于SSPC組（P<0.05），培養(yǎng)8d時兩組的葡萄糖日耗量接近一致

9、。SSPC組和PSPC組細胞活力無顯著差異，但均高于SSSC組細胞活力（P<0.05）。SEM及組織學觀察顯示SSSC組細胞僅分布在支架周緣而SSPC組和PSPC組細胞在支架內(nèi)部及周邊均有分布且兩組的細胞占孔率均高于SSSC組（P<0.05）。結論：PSPC法體外構建組織工程骨的效果優(yōu)于SSSC法；培養(yǎng)8d后SSPC法和PSPC法的構建效果相似，但PSPC法可顯著促進培養(yǎng)初期細胞增殖從而加快組織構建速度，隨著支架載體體積和孔隙空間的增加

10、這一優(yōu)勢可能更加明顯。
　　4.灌注法結合可控微結構β-TCP支架體外構建大體積組織工程骨
　　目的：探討采用灌注培養(yǎng)方法和可控微結構β-TCP支架體外構建大體積組織工程骨的構建效果以及支架微結構在其中的作用。方法：以快速成形（RP）技術制備的大體積可控微結構β-TCP支架為載體，采用自行設計的灌注式生物反應器進行人胚胎成骨細胞的灌注性三維培養(yǎng)，以靜態(tài)培養(yǎng)方法為對照，通過葡萄糖日消耗量、細胞活力檢測、組織學觀察和計量、SEM

11、觀察及X射線能譜（EDX）分析，比較兩種培養(yǎng)方法對支架內(nèi)細胞增殖和分布的影響。結果：葡萄糖日耗量和細胞活力均隨培養(yǎng)時間延長而升高（P<0.05），灌注培養(yǎng)組的葡萄糖日耗量和細胞活力顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組（P<0.05）。組織學及SEM觀察顯示靜態(tài)培養(yǎng)條件下細胞僅在支架邊緣存活而灌注培養(yǎng)條件下細胞在支架內(nèi)部和邊緣均能正常生長，細胞數(shù)量明顯多于靜態(tài)培養(yǎng)組；灌注培養(yǎng)支架內(nèi)形成了以正交管道結構為模板的新生三維組織。EDX分析證實胞外類球體基質為磷酸

12、鈣結節(jié)。結論：灌注培養(yǎng)方法結合可控微結構β-TCP支架促進大體積支架內(nèi)細胞均勻擴增和成骨分化；可控正交管道結構利于支架內(nèi)形成均勻一致的營養(yǎng)供應和流體應力刺激環(huán)境；可控微結構可能影響新生組織的形態(tài)和分布。
　　5.灌注法構建組織工程骨修復兔橈骨節(jié)段性缺損研究
　　目的：探討灌注性細胞接種和培養(yǎng)方法體外構建組織工程骨以及修復兔橈骨節(jié)段性缺損的可行性和效果。方法：以RP技術制備的可控微結構β-TCP支架為載體，采用自行設計的生物反

13、應器進行兔成骨細胞的灌注接種和灌注培養(yǎng)（PSPC），以靜態(tài)接種和靜態(tài)培養(yǎng)（SSSC）以及靜態(tài)接種和灌注培養(yǎng)（SSPC）方法為對照，通過葡萄糖日耗量、細胞活力檢測和組織學觀察，對比三種方法的細胞增殖和分布情況；將組織工程骨植入兔橈骨節(jié)段性骨缺損，以缺損曠置、自體骨和單純β-TCP支架為對照，通過影像學和組織學檢查比較骨缺損的修復效果。結果：PSPC組的葡萄糖日耗量和細胞活力高于SSPC和SSSC組（P<0.05），SSSC組細胞僅在支架邊

14、緣分布而PSPC組和SSPC組細胞在支架內(nèi)部和邊緣均有分布，PSPC組的細胞占孔率高于SSPC和SSSC組（P<0.05）。植入兔橈骨缺損12周后自體骨組6例全部愈合（6/6），SSPC組有2例愈合（2/6），PSPC組有4例愈合（4/6），其余各組缺損均未愈合。PSPC組的新骨生成量高于SSPC組、SSPC組和單純β-TCP組（P<0.05）。β-TCP殘余量與SSPC組相比無顯著性差異但低于單純β-TCP和SSSC組（P<0.05）

15、。結論：PSPC法可促進支架內(nèi)細胞增殖和均勻分布，構建的組織工程骨可修復兔橈骨節(jié)段性缺損，修復效果優(yōu)于SSSC法和SSPC法但仍低于自體骨。RP支架的降解性有待改進。體內(nèi)血管化和營養(yǎng)供應障礙可能導致支架內(nèi)部分細胞死亡從而減弱了組織工程骨的修復效果。
　　綜上所述，以上研究結果說明，本研究自行設計的灌注式生物反應器可用于多孔支架材料上的成骨細胞灌注性接種和培養(yǎng)；與傳統(tǒng)的靜態(tài)細胞接種和培養(yǎng)方法以及采用靜態(tài)接種的灌注培養(yǎng)方法相比，灌注性