丙型肝炎患者抗—F流行率及F蛋白對細胞（抑）癌基因的調節(jié)作用.pdf

1、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬(Flaviviridaehepacivirus)，為顆粒狀單正鏈RNA病毒。HCVHCV可以導致急性、慢性肝炎和肝纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)。HCV基因組全長約9600個核苷酸，結構為：5’非編碼區(qū)(5’UTR)-結構蛋白(核心蛋白C-包膜蛋白E1、E2)-非結構蛋白(P7-NS2-

2、NS3-NS4-NS5)-3’非編碼區(qū)(3’UTR)。HCV基因組僅含有一個開放讀碼框(openreadingframe，ORF)，編碼大約3010個氨基酸的多蛋白前體，前體蛋白在翻譯同時或翻譯后被宿主細胞及病毒自身編碼的蛋白酶水解為C～NS5b的10種結構和非結構蛋白。HCVF蛋白是C基因+1移位后所形成新讀框(alternativereadingframe，ARF，C基因密碼子第2位堿基為新讀框密碼子第1位堿基)編碼的基因產(chǎn)物，作為

3、新近鑒定出的HCV基因組編碼產(chǎn)物，目前對F蛋白的生物學性狀研究尚處在起步階段。本研究利用大腸桿菌表達的重組HCVF蛋白為捕獲抗原，ELISA檢測HCV感染者血清中抗體情況，了解F蛋白是否可以在感染者體內天然表達。結合HCV感染者臨床資料，初步評價F蛋白與丙型肝炎的疾病相關性，以及在HCV感染的實驗室檢測及誘導保護性中和抗體中的作用。另一方面，利用Westernblot和實時定量PCR技術檢測表達F蛋白的HepG2細胞中3種(抑)癌基因變

4、化，借以判斷F蛋白在HCV相關的HCC發(fā)生中的作用。 一、丙型肝炎患者中抗-F的血清抗體流行率以HCV1b亞型序列為模板，擴增氨基端部分缺失的HCVF基因讀框(codon75～codon134)至原核表達載體pET32a，含F(xiàn)基因質粒轉化大腸桿菌，表達產(chǎn)物用Ni-NTA樹脂純化。以純化蛋白作為捕獲抗原，包被酶標平板，間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(EIA)檢測35份HCV感染者、8份非HCV感染肝病患者及10份健康人血清標本。以健康者血清

5、OD450nm均值+0.1作為陽性判定值，分析HCV感染者血清抗-F陽性率，結合患者臨床資料，統(tǒng)計學分析F蛋白與HCV感染的疾病指標相關性。結果顯示，在35份HCV感染者血清標本中，抗-F的陽性率為43％(15/35)，對照組(8份非HCV肝病患者及10份健康人)血清中抗-F無一例陽性，兩組之間OD450nm均值和抗-F陽性率都存在顯著的統(tǒng)計學差異，P＜0.005，說明F蛋白可以在HCV感染者體內天然地表達，并誘生特異性體液免疫反應?？?/p>

6、方檢驗未發(fā)現(xiàn)抗-F與HCV感染者年齡、性別、病程及血清HCVRNA載量之間存在相關性。其中，抗-F在四種HCV感染病程中的檢出率分別為：急性50％(3/6)、慢性輕度50％(7/14)、慢性中度27％(3/11)、慢性重度50％(2/4)(慢性中度組與其它三組比較無差異，p＞0.1)。抗-F在HCV感染急性期和慢性期有穩(wěn)定的檢出率(50％和41％)說明HCVF蛋白在HCV感染者體內變異小，能夠穩(wěn)定誘導宿主體液免疫反應，具備作為實驗室診斷

7、HCV感染的候補抗原價值?？?F與HCV感染病程無關，提示其造成免疫損傷的可能性較小，HCVF蛋白具有作為保護性疫苗的深入研究意義。 二、F蛋白對細胞內c-myc、p21和p53表達的影響以pGEM-HCJ4質粒(含全長1b亞型HCV基因組)為模板，設計合適引物，PCR擴增完整讀框HCVF基因和C基因，選擇合適酶切位點分別克隆至pcDNA3.1+真核表達載體。此外，構建含CF融合基因的表達載體。含HCVF基因質粒單獨或以不同比例

8、(10∶1，1∶1，1∶10)與含C基因質粒共轉染HepG2細胞，24h～48h瞬時檢測兩蛋白表達。以重組HCVF抗原免疫家兔血清作為抗F蛋白-抗，HCV感染者混合血清(ELISA試劑盒證實抗HCV陽性)作為抗C蛋白-抗，Westernblot證實HCVF蛋白和C蛋白在HepG2細胞內瞬時表達。轉染48h，Westernblot或qPCR法檢測轉染細胞癌基因c-myc和抑癌基因p21、p53表達，相對于空載體(目標基因表達量標定為100

9、％)，HCVF蛋白分別升高了HepG2細胞c-myc和p21表達量3.8倍和41％(表達量分別為480％和141％，以下依此類推)，降低了p53表達67％，C蛋白升高c-myc和p21表達量60％和21％，降低了p53表達59％。qPCR檢測p21、p53表達結果與Westernblot結果一致，說明F蛋白調節(jié)三基因表達發(fā)生在基因轉錄水平上。HCVF蛋白影響(抑)癌基因表達幅度與C蛋白存在差別，但調節(jié)趨勢一致。HCVF基因質粒與C基因質

10、粒按照10∶1、1∶1、1∶10比例共轉染HepG2細胞，相對于空載體轉染細胞目標基因表達量100％而言，c-myc表達量分別為1.7、5.5、1.8，p21表達量分別為1.18、1.24、1.25，p53表達量分別為0.87、0.72、0.44；HCVCF融合基因質粒轉染細胞的c-myc、p21和p53表達量分別為2.1、1.29和0.68。HCVF蛋白與C蛋白共表達對三種基因轉錄無加強或者減弱的情況，提示在影響(抑)癌基因上，不存在

11、F蛋白與C蛋白相互作用的證據(jù)。HCVF蛋白影響細胞(抑)癌基因表達是個復雜的雙向調節(jié)過程，它既可以通過增加癌基因c-myc轉錄水平和降低抑癌基因p53轉錄來促進感染細胞轉化，也能通過增加抑癌基因p21的轉錄來抑制宿主細胞惡變。 三、小結1、以重組HCVF蛋白為捕獲抗原，EIA檢測各期HCV感染者血清中抗-F陽性率為43％(15/35)，8份非HCV感染的肝病患者和10份健康人血清無一例陽性，證明F蛋白作為新被證實的HCV基因組編

12、碼產(chǎn)物，可以特異性地在HCV感染者體內天然表達和誘生特異性的體液免疫反應?？?F在HCV感染各個病程中檢出率穩(wěn)定在40％～50％，顯示出體內穩(wěn)定表達的F蛋白具有作為HCV實驗室診斷的候補抗原價值?？?F與HCV感染的疾病輕重程度無關，其具有的免疫損傷可能性較小，如能進一步證實抗-F具有中和保護作用，則HCVF蛋白將具有作為誘導保護性抗體的疫苗價值。 2、借助pcDNA3.1+真核表達系統(tǒng)，HCVF蛋白可以單獨或以不同比例與C蛋白

13、在HepG2細胞內瞬時(48h)表達，對c-mye、p21和p53mRNA和蛋白水平的qPCR及Westernblot檢測顯示，同C蛋白一樣，F(xiàn)蛋白升高c-myc、p21表達，降低p53表達。共轉染實驗未能證明在影響(抑)癌基因轉錄上F蛋白與C蛋白存在相互作用。HCVF蛋白影響HCC發(fā)生存在雙向性，它一方面通過升高癌基因c-myc和降低抑癌基因p53的表達促進肝細胞轉化，另一方面，它通過上調抑癌基因p21的表達減低前者的誘導癌變作用。