RAPD-PCR技術(shù)用于啤酒生產(chǎn)過程中微生物檢測的研究.pdf

1、污染微生物的各種代謝產(chǎn)物,多能造成啤酒異味、混濁和沉淀,嚴(yán)重影響啤酒的質(zhì)量.目前,國內(nèi)對啤酒中腐敗微生物鑒定的傳統(tǒng)方法都不同程度地存在試驗(yàn)周期長、準(zhǔn)確性不高、自動化程度低等不利因素.PCR技術(shù)為檢測啤酒雜菌提供了快捷、靈敏、準(zhǔn)確的方法,可在短期內(nèi)對污染菌進(jìn)行檢測.我們用玻璃珠法、溶菌酶法、凍融法、氯化芐法(phCH<,2>Cl)對啤酒發(fā)酵液混合菌、生產(chǎn)用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、K氏酵母、啤酒生產(chǎn)污染

2、菌(細(xì)菌T、W、Y)、G<'->細(xì)菌、G<'+>細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行提取,通過對不同方法裂解細(xì)胞效率的比較、DNA濃度測定、電泳檢測和RAPD-PCR擴(kuò)增進(jìn)行分子識別和檢測技術(shù)研究.結(jié)果表明,溶菌酶法和凍融法對細(xì)菌的裂解率為99％-100％,對酵母的裂解率只有15％-28％;玻璃珠法對酵母的裂解率為92％-94％;phCH<,2>Cl法對細(xì)菌和酵母的裂解率均為100％.提取啤酒發(fā)酵液混合菌基因組DNA,濃度測定結(jié)果分別為:玻璃珠法15

3、.4μg/mL、溶菌酶法18.0μg/mL、phCH<,2>Cl法40.7μg/mL.電泳檢測結(jié)果表明,4種方法得到的混合菌DNA均大于23kb,無拖尾、無蛋白污染.phCH<,2>Cl法圖譜更清晰,DNA得率29.94μg/mg濕菌體.RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,溶菌酶法和phCH<,2>Cl法所提DNA的PCR圖譜清晰,重復(fù)性好.用76條隨機(jī)引物對S.cerevisiae基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增,凝膠電泳檢測,結(jié)果表明

4、,16條引物沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,60條引物有擴(kuò)增產(chǎn)物,且每條引物擴(kuò)增效果存在差異.通過比較,根據(jù)圖譜清晰、條帶數(shù)量適中、主帶明顯的原則,初步篩選出16條引物.用選出的16條隨機(jī)引物對12株不同菌株(10株酵母菌,2株細(xì)菌)基因組DNA進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,大部分引物都有擴(kuò)增產(chǎn)物.通過比較,根據(jù)圖譜條帶差異程度大、具有特征性主帶的標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步篩選出4條引物,用于鑒別不同的酵母菌和細(xì)菌.W與S.cerevisiae各有其獨(dú)特穩(wěn)定的R

5、APD-PCR指紋圖譜,混合菌的圖譜為兩菌圖譜的疊加.用引物S106進(jìn)行PCR,W在771bp處有一條非常亮的帶,S.cerevisiae在該位置沒有條帶.兩菌按一定比例混合,提取基因組DNA,PCR檢測混合菌體系中W檢出靈敏度,結(jié)果表明,W占混合菌菌量的0.1％時,可被RAPD-PCR方法所檢測.酒精酵母(As2.399)與S.cerevisiae的混合菌體系也得到相同的結(jié)論,表明RAPD-PCR在混合菌體系中的檢出靈敏度可達(dá)到0.1