Wnt信號(hào)通路與肝門部膽管癌.pdf

1、肝門部膽管癌(hilar cholangiocarcinoma)作為肝外膽管癌的一種，因其特殊的局部解剖位置和生物學(xué)特性，往往起病隱匿，早期診斷十分困難。手術(shù)切除是目前肝門部膽管癌治療的主要手段。但由于肝門部解剖的復(fù)雜性和肝門部膽管癌位置的特殊性，肝門部膽管癌的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)巨大。目前，國內(nèi)和國際上應(yīng)用比較廣泛的肝門部膽管癌術(shù)前分期、分型系統(tǒng)雖然對肝門部膽管癌的術(shù)前評估有著積極的影響，但也存在不足，還有待進(jìn)一步完善。因此有效并合理的選擇肝門部

2、膽管癌的手術(shù)方式，將對提高根治性切除率，并最終提高患者生存期產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。 Wnt信號(hào)通路是一條在動(dòng)植物體內(nèi)高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)并控制著諸多生命過程，包括生物體的生長、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等；也包括細(xì)胞形態(tài)與功能的分化與維持、免疫、應(yīng)激、細(xì)胞癌變與細(xì)胞凋亡等。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路也被稱做Wnt/β—catenin信號(hào)通路，它的異常激活已被證明與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3][4][5][6][13][14]。但是其

3、在膽管癌尤其是肝門部膽管癌中的表達(dá)及激活卻鮮有報(bào)道。 本研究旨在通過對臨床病例的回顧分析，探討不同分期、分型系統(tǒng)對肝門部膽管癌手術(shù)切除效果及預(yù)后的影響。并進(jìn)一步通過組織芯片聯(lián)合免疫組化技術(shù)，研究肝門部膽管癌組織中Wnt經(jīng)典通路的表達(dá)及其異常激活與手術(shù)切除效果及預(yù)后的關(guān)系。同時(shí)，利用體外培養(yǎng)細(xì)胞系研究Wnt經(jīng)典通路在不同膽管癌細(xì)胞系內(nèi)的表達(dá)及激活情況。最后利用siRNA技術(shù)，探討以Wnt經(jīng)典通路為靶點(diǎn)的肝門部膽管癌基因治療方法，為

4、肝門部膽管癌的治療提供更多可行的選擇。 第一部分肝門部膽管癌的手術(shù)治療及預(yù)后分析 一、目的： 探討改良T—分期系統(tǒng)及Bismuth—Corlette分型系統(tǒng)對于肝門部膽管癌手術(shù)切除效果及預(yù)后的影響，并對影響手術(shù)切除效果及預(yù)后的相關(guān)因素進(jìn)行分析。 二、方法： 回顧性分析我院自1997年4月～2007年5月10年間確診為肝門部膽管癌并行手術(shù)治療患者175例。評價(jià)建議性T分期系統(tǒng)及Bismuth—Cor

5、lette分型系統(tǒng)對肝門部膽管癌手術(shù)切除能效及預(yù)后的影響。并通過單因素及多因素分析，探討肝門部膽管癌手術(shù)切除能效及預(yù)后的影響因素。 三、結(jié)果： Bismuth—Corlette分型系統(tǒng)和建議性T分期系統(tǒng)對于肝門部膽管癌手術(shù)切除能效的評估有重要作用，隨分級(jí)等級(jí)升高手術(shù)切除率下降，但仍有待完善。 T分期的T1和T2期、Bismuth分型的Ⅱ型和Ⅲa型、聯(lián)合右半肝切除、手術(shù)持續(xù)時(shí)間、腫瘤大體最小徑可作為手術(shù)切除能效

6、的獨(dú)立影響因素。 Bismuth—Corlette分型系統(tǒng)和建議性T分期系統(tǒng)對肝門部膽管癌術(shù)后患者預(yù)后的影響均無意義。腫瘤的最大直徑、腫瘤的最小直徑、肝動(dòng)脈受侵犯、入院ALT值、入院CA19-9值被認(rèn)為是預(yù)后獨(dú)立影響因素。 四、結(jié)論： Bismuth—Corlette分型系統(tǒng)和建議性T分期系統(tǒng)對于肝門部膽管癌手術(shù)切除能效的評估有積極作用，但對患者預(yù)后的影響無意義，可通過加入肝動(dòng)脈侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等因

7、素而完善。 第二部分 Wnt經(jīng)典通路相關(guān)因子在肝門部膽管癌患者組織中的表達(dá) 一、目的： 研究肝門部膽管癌患者組織中Wnt經(jīng)典通路相關(guān)因子及其靶基因的表達(dá)，探討Wnt經(jīng)典通路在肝門部膽管癌組織中異常激活的意義。 二、方法： 收集我院自1997年4月～2007年5月10年間確診為肝門部膽管癌并行手術(shù)治療之患者病理存檔標(biāo)本129例，以肝內(nèi)膽管癌手術(shù)患者存檔標(biāo)本31例及先天性膽總管囊腫患者存檔標(biāo)本45例為

8、對照組，構(gòu)建組織芯片。采用免疫組化染色技術(shù)，檢測Wnt經(jīng)典通路相關(guān)因子及其靶基因的表達(dá)情況，對比其在不同疾病中的異同，并行相關(guān)性分析。通過單因素及多因素分析，探討各指標(biāo)表達(dá)及通路激活情況對肝門部膽管癌手術(shù)切除能效及預(yù)后的影響。 三、結(jié)果： Wnt2、β—catenin、TCF4在肝門部膽管癌中均有較高表達(dá)，且多以強(qiáng)陽性表達(dá)為主，其中Wnt2、β—catenin、TCF4的表達(dá)明顯均高于肝內(nèi)膽管癌；Wnt2、TCF4的表

9、達(dá)則明顯高于先天性膽總管囊腫。c—myc及cyclinD1在肝門部膽管癌中均有較高表達(dá)，與肝內(nèi)膽管癌及先天性膽總管囊腫相比有明顯差異。 Wnt經(jīng)典通路在3組標(biāo)本組織中均出現(xiàn)激活，以肝門部膽管癌內(nèi)Wnt經(jīng)典通路的激活水平為最高，明顯高于先天性膽總管囊腫，但與肝內(nèi)膽管癌相比無明顯差異。 Wnt通路激活對于T分期、Bismuth分型、患者病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯影響，對于患者生存時(shí)間亦無影響。 cyclin

10、D1表達(dá)水平、Wnt通路激活、Wnt通路可疑激活為手術(shù)切除效果影響因素。其中cyclin D1的陽性表達(dá)為獨(dú)立影響因素。 cyclin D1表達(dá)、Wnt通路可疑激活情況為預(yù)后影響因素。其中Wnt通路可疑激活為預(yù)后獨(dú)立影響因素。 Wnt2表達(dá)與c—myc表達(dá)正相關(guān)，與Wnt通路可疑激活情況負(fù)相關(guān)。Wnt3表達(dá)與β—catenin胞漿表達(dá)正相關(guān)。Wnt通路激活與β—catenin及TCF4胞核內(nèi)表達(dá)情況呈正相關(guān)。Wnt通

11、路可疑激活與Wnt通路激活情況呈正相關(guān)。 四、結(jié)論： 在肝門部膽管癌組織中存在較高水平Wnt經(jīng)典通路的激活以及其激活所引起的下游靶基因c—myc的表達(dá)。Wnt經(jīng)典通路的激活及cyclin D1的表達(dá)對于肝門部膽管癌患者手術(shù)切除能效及患者預(yù)后有著重要影響。 第三部分 Wnt通路相關(guān)因子在膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其siRNA干擾實(shí)驗(yàn) 一、目的： 以體外培養(yǎng)的膽管癌細(xì)胞系為基礎(chǔ)，進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt經(jīng)典通路在

12、體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并利用siRNA技術(shù)探討抑制Wnt經(jīng)典通路特定靶點(diǎn)從而抑制Wnt通路活化的可能，為肝門部膽管癌的基因治療提供更多的選擇。 二、方法： 按不同來源之體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞系分組，利用RT—PCR技術(shù)、Western—Blot技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)分別從mRNA水平、蛋白水平檢測Wnt經(jīng)典通路相關(guān)因子及其靶基因的表達(dá)情況。 利用RNAi干涉技術(shù)，將靶向Wnt2及β—catenin的siRNA

13、投遞入細(xì)胞系FRH0201，利用RT—PCR技術(shù)、Western—Blot技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)、流式細(xì)胞儀技術(shù)、MTT細(xì)胞增殖檢測方法分別從mRNA水平、蛋白水平、細(xì)胞周期、凋亡、增殖水平檢測siRNA轉(zhuǎn)染前后Wnt經(jīng)典通路相關(guān)因子及其靶基因的表達(dá)情況。 三、結(jié)果： Wnt經(jīng)典通路在體外培養(yǎng)肝門部膽管癌細(xì)胞系FRH0201及肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系HCCC9810、SSP—25、RBE中均有激活，但其核心因子Wnt2、Wnt

14、3、TCF4、β—catenin及其靶基因c—myc、cyclin D1在4種細(xì)胞系中的表達(dá)存在差異，以FRH0201中表達(dá)為高。 以lipofectamin2000為載體投遞靶點(diǎn)分別為Wnt2和β—catenin的siRNA入FRH0201細(xì)胞系，投遞效率超過50％，并明顯敲低靶點(diǎn)基因表達(dá)，其mRNA水平沉默效率超過90％。轉(zhuǎn)染該siRNA后可明顯抑制Wnt經(jīng)典通路的活性，并在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)c—myc的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，