pUDK-HGF相關(guān)藥學(xué)和基因治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、pUDK—HGF是由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶人肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因真核表達(dá)的質(zhì)粒。實(shí)驗(yàn)表明pUDK—HGF可促進(jìn)肢體缺血部位的血管生成，從而改善肢體功能。pUDK-HGF具有開發(fā)成為新的基因藥物的前途。pUDK—HGF已獲中國專利?！爸亟M質(zhì)粒一肝細(xì)胞生長因子注射液”正在注冊申請進(jìn)行肢體動脈閉塞癥的基因治療臨床試驗(yàn)。 一、質(zhì)粒pUDK-HGF的大規(guī)模制各和質(zhì)量分析 質(zhì)粒pUDK-HGF的大規(guī)模制備是其藥學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，

2、建立了pUDK-HGF中試生產(chǎn)流程，主要包括發(fā)酵、細(xì)菌堿液裂解、Q—SepharoseXL色譜柱富集質(zhì)粒、SephacryS1000凝膠色譜分離、Sourcel5Q色譜精制分離、質(zhì)粒沉淀、重溶、無菌過濾及分裝等步驟。并對發(fā)酵條件如培養(yǎng)基、pH值、轉(zhuǎn)速、細(xì)菌堿性裂解及色譜分離條件進(jìn)行了優(yōu)化。所建立的生產(chǎn)流程重復(fù)性良好，質(zhì)粒DNA的回收率較高(約45％)。經(jīng)質(zhì)量檢定其產(chǎn)品均符合擬定的各項(xiàng)質(zhì)量檢定指標(biāo)。所有步驟采用一般生物制品制備方法，沒有特

3、殊的技術(shù)要求和使用特殊的試劑等，存在進(jìn)一步放大規(guī)模的可能性。 根據(jù)相關(guān)國外文獻(xiàn)報(bào)道及我國基因治療質(zhì)量控制指導(dǎo)原則，制定pUDK—HGF質(zhì)粒制造檢定規(guī)程，并按此逐項(xiàng)對本實(shí)驗(yàn)室中試生產(chǎn)制備的05批次pUDK-HGF的質(zhì)量進(jìn)行了分析研究。05批次pUDK—HGF的主要質(zhì)量如下：pUDK—HGF濃度為2．0lmg/ml；A260/A280=1．86；超螺旋pUDK—HGF比例為95．09％；電泳圖中未見RNA；殘留宿主DNA含量<0．2

4、％質(zhì)粒DNA：菌體蛋白質(zhì)殘留含量

5、肉注射質(zhì)粒DNA基因表達(dá)的動態(tài)觀察 pUDK—HGF能在注射局部表達(dá)HGF，促進(jìn)肢體缺血部位的血管生成，從而改善肢體功能。但pUDK～HGF局部表達(dá)HGF的消長規(guī)律，以及pUDK-HGF在其他組織中的分布情況還不明了。本工作利用與pUDK—HGF具有類似的結(jié)構(gòu)件(CMV啟動子、卡那霉素抗性基因、polyA等)、并攜帶熒光素酶基因的重組質(zhì)粒pUDK—LUC，采用活體成像技術(shù)實(shí)時(shí)直觀觀察質(zhì)粒DNA在體內(nèi)表達(dá)的持續(xù)性以及在組織中的分布

6、。本工作對認(rèn)識動物肌肉注射pUDK—HGF后，局部表達(dá)HGF的消長規(guī)律，以及pUDK—HGF在其他組織中的分布提供有益的幫助。 小鼠腿部骨胳肌注射質(zhì)粒pUDK—LUC后4—5天熒光素酶表達(dá)達(dá)高峰值，隨后下降，而注射后第3周表達(dá)量出現(xiàn)反彈上升，并在隨后的實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)(目前為止8周)呈較為穩(wěn)定的表達(dá)。小鼠腹部及背部分別遮擋熒光部位后，均未觀察到其他部位熒光素酶的表達(dá)。于第12小時(shí)、24小時(shí)活殺小鼠取心、肝、脾、肺、腎、注射部位肌肉以

7、及暴露腹腔，也未觀察到其他臟器以及暴露腹腔中有熒光素酶的表達(dá)。結(jié)果表明肌肉注射質(zhì)粒pUDK—LUC一段時(shí)間內(nèi)可在局部獲得較為穩(wěn)定的基因表達(dá)，而其他臟器無明顯表達(dá)。 三、pUDK-HGF對CCl4／高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肝脂肪變和纖維化的基因治療 肝脂肪變性是臨床常見肝病，與肝纖維化、肝硬化常常相繼發(fā)生或同時(shí)存在。脂肪肝被認(rèn)為是肝纖維化、肝硬化的前期病變。病毒性肝炎肝脂肪變性程度越重預(yù)示肝纖維化的發(fā)生率越高且程度越重。目前尚無特

8、效的治療肝脂肪變的藥物和方法。也缺少能對肝脂肪變性和肝纖維化同時(shí)具有治療作用的藥物和技術(shù)手段。本工作嘗試用pUDK—HGF對大鼠慢性肝脂肪變和肝纖維化進(jìn)行基因治療。 本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)加40％CCl4橄欖油溶液注射方法，造模4周即出現(xiàn)肝脂肪變性和肝纖維化，在肝臟上直接注射不同劑量的pUDK—HGF。給藥后3周各給藥組與模型組、空質(zhì)粒組比較，血清生化指標(biāo)AST、ALT、ALB等明顯改善。肝臟組織中蓄積的甘油三酯和丙二醛含量明顯