核殼型n-HA-ZrO-,2-支架材料的制備及其生物相容性評(píng)價(jià).pdf

1、因牙周病導(dǎo)致的牙周組織缺損修復(fù)再生難度很大，牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周膜的完全功能性再生一直是牙周病學(xué)的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的牙周治療只能部分恢復(fù)牙周組織，近年發(fā)展起來的引導(dǎo)組織再生技術(shù)(GuidedTissueRegeneration，GTR)可使牙周組織獲得一定程度的再生，但總體而言，尚不能達(dá)到牙周組織的完全再生。將組織工程(TissueEngineering，TE)原理與技術(shù)引入牙周病治療中，為牙周組織再生帶來了新思路。 牙周組織工程

2、技術(shù)的主要原理：將在體外培養(yǎng)的高濃度的功能相關(guān)的種子細(xì)胞接種于天然的或人工合成的具有良好生物與力學(xué)性能的支架材料上，經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)，將種子細(xì)胞-支架材料復(fù)合體植入牙周病變部位，在支架材料逐步降解的同時(shí)，種子細(xì)胞在細(xì)胞活性因子的作用下增殖，形成新的具有原來形態(tài)與功能的牙周組織。 近年來，牙周組織工程研究的熱點(diǎn)主要集中在(1)種子細(xì)胞；(2)細(xì)胞種植基質(zhì)材料(支架材料)；(3)組織培養(yǎng)中調(diào)節(jié)該細(xì)胞增殖，保持表型等特征的生物活性因子。

3、如何選擇支架材料是牙周組織再生研究中的熱點(diǎn)，目前牙周組織工程研究多選用生物陶瓷作為支架材料，生物陶瓷具有良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)性、較佳的生物活性等特點(diǎn)，作為植骨代用材料效果是肯定的，但要應(yīng)用于牙周組織工程，還存在材料的脆性大，柔韌性不夠，在體內(nèi)降解困難，影響了新生骨組織的長入與后期的骨改建等缺陷。 研究目的： 采用納米材料與增韌技術(shù)，用水熱法制備出一種孔隙率高、韌度大、生物力學(xué)性能良好的核殼型納米羥基磷灰石包覆

4、二氧化鋯復(fù)合生物陶瓷材料(以下簡稱核殼型n—nA/ZrO2支架材料)。在材料表征與物理學(xué)性能檢測(cè)的基礎(chǔ)上，對(duì)核殼型n—HA/ZrO2支架材料的生物相容性進(jìn)行初步的探討，初步獲取體內(nèi)植入的直接依據(jù)，為下一步應(yīng)用于牙周組織工程奠定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法： 1.在探討制備納米羥基磷灰石(flaflo—hydroxyapatite，n—HA)較佳PH值及水熱時(shí)間對(duì)n—HA結(jié)晶的影響基礎(chǔ)上，確定材料制備參數(shù)為：PH=9，t=6h，T

5、=180℃，在二氧化鋯(ZrO2)前驅(qū)體ZrO2·xH2O上分步加入鈣和磷酸根離子，并同時(shí)控制PH值，使n—HA在ZrO2·xH2O表面沉積，制備出具有包覆結(jié)構(gòu)的晶粒，然后進(jìn)行水熱處理，制備出核殼型n-HA/ZrO2支架材料。進(jìn)行TEM觀察材料表面結(jié)構(gòu)形貌觀察，通過XRD分析材料構(gòu)成，同時(shí)測(cè)定材料孔隙大小、抗壓強(qiáng)度和抗折強(qiáng)度。 2.按ISO10993和國家GB/T16886中的系列標(biāo)準(zhǔn)要求，對(duì)制備的核殼型n—HA/ZrO2支架材

6、料進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)、熱原實(shí)驗(yàn)、兔肌肉植入實(shí)驗(yàn)，以綜合評(píng)價(jià)其生物相容性。 (1)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：將濃度為100g/L的核殼型n—HA/ZrO2支架材料浸提液(實(shí)驗(yàn)組)、100g/L聚乙烯浸提液(陰性對(duì)照組)、6.4％苯酚溶液(陽性對(duì)照組)各3ml，置于φ35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，加入濃度為6×104/mlL929細(xì)胞懸液3ml共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。將濃度為6×104/ml細(xì)胞懸液接種于實(shí)驗(yàn)組(支架材料浸

7、提液)、陰性對(duì)照組(聚乙烯浸提液)、陽性對(duì)照組(6.4％苯酚溶液)中培養(yǎng)，采用MTT比色法測(cè)定L929細(xì)胞培養(yǎng)24h，48h，72h的相對(duì)增殖率(RGR)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)材料的細(xì)胞毒性。 (2)急性全身毒性實(shí)驗(yàn)：用100g/L的核殼型n—HA/ZrO2支架材料的浸提液小鼠尾靜脈注射，陰性對(duì)照為同批號(hào)生理鹽水，陽性對(duì)照為6.4％苯酚溶液，劑量均為50mg/kg，觀察注射后1、3、5、7天小鼠一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)、死亡情況及體重

8、變化，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)材料的急性全身毒性。 (3)溶血實(shí)驗(yàn)：將100g/L的核殼型n—HA/ZrO2支架材料浸提液(實(shí)驗(yàn)組)、生理鹽水(陰性對(duì)照組)和滅菌蒸餾水(陽性對(duì)照組)各10ml，分別與0.2ml經(jīng)稀釋的兔血混合，測(cè)定兔紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離程度，對(duì)支架材料體外血液相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 (4)熱原實(shí)驗(yàn)：按標(biāo)準(zhǔn)三只兔方法，以10ml/kg的劑量，將100g/L的核殼型n—HA/ZrO2支架材料浸提液注入兔耳緣靜脈，

9、給藥后連續(xù)測(cè)量兔體溫并與實(shí)驗(yàn)前預(yù)檢體溫相比較，評(píng)價(jià)支架材料的制熱作用。 (5)兔肌肉植入實(shí)驗(yàn)：將核殼型n—HA/ZrO2支架材料植入兔背部肌肉中，分別于術(shù)后15d、30d、60d、90d后取出進(jìn)行大體觀察與組織病理學(xué)檢查，觀察支架材料植入后的軟組織炎癥反應(yīng)程度與纖維囊形成情況，評(píng)價(jià)材料植入肌肉后的組織反應(yīng)。 結(jié)果： 1.采用納米材料與陶瓷增韌技術(shù)，利用水熱法制備出核殼型n—HA/ZrO2支架材料，XRD檢測(cè)證實(shí)H

10、A已經(jīng)包覆在ZrO2粒子的表面，TEM形貌分析材料成分為納米級(jí)別的HA和zrO2，兩種粒子呈現(xiàn)出相互包覆的核殼狀結(jié)構(gòu)，材料力學(xué)性能檢測(cè)材料孔隙率為60％～80％，孔隙分布均勻、貫通，孔徑大小在100～400μm之間，抗壓強(qiáng)度為8.5MPa，抗折強(qiáng)度為4.6MPa。材料性能達(dá)到人體骨組織的要求，符合骨組織工程支架材料的基本理化性能要求。 2.核殼型n—HA/ZrO2支架材料生物相容性評(píng)價(jià)：以L929為測(cè)試細(xì)胞，MTT比色法測(cè)定支架

11、材料細(xì)胞毒性為0～I(xiàn)級(jí)；全身毒性實(shí)驗(yàn)支架材料組小鼠一般狀況良好，未見明顯毒性表現(xiàn)，體重均出現(xiàn)增長，無動(dòng)物死亡；支架材料體外溶血率為1.6％，體外實(shí)驗(yàn)不引起溶血反應(yīng)；材料不引起熱原反應(yīng)；兔肌肉植入實(shí)驗(yàn)中組織學(xué)觀察顯示，植入支架材料組織相容性良好。 結(jié)論： 1.采用納米材料與陶瓷增韌技術(shù)，優(yōu)化水熱法制備參數(shù)，可成功制備出材料學(xué)性能良好，符合組織工程支架材料基本理化性能要求的核殼型n—HA/ZrO2支架材料。 2.按I