第一部分 Il-35在原發(fā)免疫性血小板減少癥免疫失耐受中作用的研究第二部分 干擾素α-2b對原發(fā)性血小板增多癥患者異常骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性及功能的系統(tǒng)研究.pdf

1、第一部分IL-35在原發(fā)免疫性血小板減少癥免疫失耐受中的作用研究
　　背景:原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫介導的出血性疾病，由于免疫失耐受體內(nèi)產(chǎn)生針對自身血小板的抗體，導致血小板破壞過多及生成減少。IL-35為IL-12家族的新成員，是在機體炎癥反應過程中由活化的天然型調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)產(chǎn)生的一種細胞因子。它能誘導效應T細胞分化為可分泌IL-3

2、5的誘導型調(diào)節(jié)性T細胞(iTr35)，從而形成級聯(lián)放大效應，最終產(chǎn)生感染耐受。既往研究發(fā)現(xiàn)維持機體免疫平衡的nTreg在ITP患者外周血中存在數(shù)量減少及抑制功能的減弱，且ITP患者外周血血漿中IL-35的水平顯著下調(diào)，且與血小板計數(shù)呈正相關，提示IL-35可能參與了ITP的發(fā)病，但具體的機制尚不清楚。
　　目的:我們擬通過本研究闡明IL-35在ITP患者中下調(diào)的原因及在免疫失耐受中的作用，同時評價體外誘導iTr35對血小板特異性自

3、身免疫的調(diào)節(jié)作用，為基于IL-35的靶向治療提供依據(jù)。
　　方法:(1)收集患者臨床資料;(2)流式細胞術檢測ITP患者外周血中調(diào)節(jié)性T細胞和輔助性T細胞（Th1和Th17）及IL-35刺激對后CD4+、CD8+和調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的表達水平的影響;(3) Brdu細胞摻入法檢測IL-35對外周血單個核細胞(PBMCs)增殖的影響;(4) ELISA方法檢測ITP患者血漿中IL-35的水平以及IL-35刺激前后PBMCs培養(yǎng)上清中I

4、FN-γ、IL-10、 IL-17和TGF-β1的水平變化。
　　結果:(1)活動期ITP患者血漿中IL-35的濃度明顯低于緩解期患者及正常對照組，緩解期ITP患者血漿中IL-35的濃度明顯低于正常對照組。(2)與正常對照組相比，ITP患者外周血中nTreg的細胞比例明顯下降，Th1細胞比例明顯上調(diào)，而Th17細胞比例無統(tǒng)計學差異。(3) ITP患者血漿中下降的IL-35表達水平與患者血小板計數(shù)、外周血nTreg的細胞比例呈正相關

5、，與Th1細胞比例呈負相關，與Th17細胞比例無關。(4)外源性IL-35的加入能明顯抑制活動期ITP患者PBMCs的增殖，進而行流式細胞術檢測顯示IL-35能抑制CD4+及CD8+T細胞的增殖，但能促進nTreg的分化。(5)IL-35促進ITP患者PBMCs產(chǎn)生更多的TGF-β1和IL-10，但卻抑制其產(chǎn)生IFN-γ和IL-17。
　　結論:原發(fā)免疫性血小板減少癥患者外周血中降低的IL-35可能通過調(diào)節(jié)自身T細胞及相關細胞因子

6、參與其免疫失耐受。
　　第二部分干擾素α-2b對原發(fā)性血小板增多癥患者異常骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性及功能的系統(tǒng)研究
　　背景:原發(fā)性血小板增多癥(essential thrombocythemia，ET)是一種費氏染色體陰性的慢性骨髓增殖性腫瘤，臨床上以出血傾向和血栓形成為特點。約55％的患者存在JAK2基因突變。以往的研究主要集中于存在突變的造血干/祖細胞損傷機制方面，但因造血干/祖細胞功能缺陷、體外不易擴增和易分化等缺

7、點限制了此方面研究。最近有研究指出ET患者骨髓造血微環(huán)境可能存在缺陷。因此，研究骨髓造血微環(huán)境中的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)——各種細胞成分的前體細胞的生物學特性及其功能對于ET患者發(fā)病機制的研究具有重要意義。近三十年來，干擾素α-2b（IFNα-2b）因其抗腫瘤效應、延緩骨髓纖維化進展以及無白血病轉(zhuǎn)化風險等特點在臨床上被廣泛應用于ET患者的治療，但對于其作用

8、機制目前主要集中在IFNα-2b對惡性造血干/祖細胞效應方面的研究，其對骨髓微環(huán)境的影響目前尚不清楚。因此，深入了解IFNα-2b對ET患者骨髓微環(huán)境的影響顯得尤為重要。
　　目的:本研究旨在系統(tǒng)、全面地比較研究ET患者和正常人BM-MSCs生物學特性及功能的差異，為探討ET患者BM-MSCs損傷機制提供實驗基礎及理論依據(jù)，同時為ET患者發(fā)病機制研究探討新思路。在證實ET患者骨髓間充質(zhì)干細胞存在缺陷的基礎上進一步探討IFNα-2b

9、對ET患者異常BM-MSCs的生物學特性及功能的影響，為IFNα-2b應用于ET患者的臨床治療提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　方法:(1)從ET患者和正常人骨髓組織中采用貼壁、傳代培養(yǎng)的方法獲取相對純化的骨髓間充質(zhì)干細胞;(2)倒置顯微鏡觀察BM-MSCs形態(tài)變化;(3)流式細胞儀檢測BM-MSCs表面標志;(4)在誘導體系中，定向誘導BM-MSCs向脂肪細胞、成骨細胞分化，用油紅O染色、茜素紅染色觀測脂滴形成、鈣鹽沉積情況，比較成

10、脂、成骨的分化潛能;(5)應用CCK-8試劑盒測定BM-MSCs增殖情況并繪制增殖曲線;(6)流式細胞儀方法檢測BM-MSCs的細胞凋亡情況;(7)磁珠分選臍血來源的CD34+細胞，在兩種培養(yǎng)體系（LTC assay和MK assay）中共培養(yǎng)BM-MSCs與CD34+細胞，比較研究ET患者和正常BM-MSCs擴增CD34+細胞能力和促進造血克?。–FU-G、CFU-M、CFU-GM、CFU-Mix、BFU-E和CFU-MK）形成的能力

11、;同時比較兩種BM-MSCs表達造血生長因子（SCF、IL-6和VEGF）的異同。(8)建立BM-MSCs和正常來源的外周血單個核細胞(PBMCs)共培養(yǎng)體系，比較兩種BM-MSCs對活化后的PBMCs增殖及促進PBMCs向Treg細胞分化能力的差異。(9)若與正常來源的BM-MSCs相比，ET患者來源的BM-MSCs在上述生物學和功能檢測中存在異常，則利用上述方法檢測IFNα-2b對ET患者來源的異常BM-MSCs的生物學特性及功能的

12、影響。
　　結果:(1)成功培養(yǎng)并獲取高純度的ET患者和正常人來源的BM-MSCs;(2)在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ET患者BM-MSCs與正常BM-MSCs形態(tài)無明顯差異，二者BM-MSCs細胞均纖細、呈長梭形，規(guī)則排列生長。(3)二者BM-MSCs均高表達CD90、CD73、CD105，且表達情況無顯著差別。二者均不表達造血細胞標志CD11a、CD14、CD19、CD34、CD45及MHC-Ⅱ類分子HLA-DR。(4)在誘導培養(yǎng)

13、體系下，二者BM-MSCs均有向成骨細胞、脂肪細胞分化的能力。與正常BM-MSCs相比，ET患者BM-MSCs分化為脂肪細胞的能力無明顯變化，但分化為成骨細胞的能力減弱。(5) ET患者BM-MSCs增殖能力明顯強于正常BM-MSCs。(6) ET患者BM-MSCs較正常人BM-MSCs的細胞凋亡明顯減少。(7)與臍血來源的CD34+細胞共培養(yǎng)后，ET患者BM-MSCs擴增CD34+細胞能力和促進造血克隆形成能力（尤其是支持長期造血能力

14、和巨核細胞系造血能力）較正常BM-MSCs顯著減弱。兩種BM-MSCs均表達SCF、IL-6和VEGF，但ET患者來源的BM-MSCs上述細胞因子表達水平低于正常來源的BM-MSCs。(8)與正常來源的PBMCs共培養(yǎng)結果顯示，ET患者BM-MSCs抑制PBMCs增殖能力減弱但促進PBMCs向調(diào)節(jié)性T細胞分化的能力有增強趨勢，但尚無統(tǒng)計學差異。(9) ET患者來源的BM-MSCs形態(tài)和表面標志不受IFNα-2b的影響，但IFNα-2b可

15、使ET患者的BM-MSCs向成骨細胞、脂肪細胞定向誘導時鈣鹽沉積和脂滴形成明顯減少，抑制其成骨、成脂分化潛能。IFNα-2b可抑制ET患者來源的BM-MSCs的增殖，增加其凋亡和增強其支持造血的能力。IFNα-2b可促進ET患者的BM-MSCs表達SCF、IL-6和VEGF。另外，IFNα-2b還可增強ET患者的BM-MSCs對PBMCs的抑制作用及促進PBMCs向調(diào)節(jié)性T細胞分化的能力。
　　結論:(1)原發(fā)性血小板增多癥患者骨

16、髓間充質(zhì)干細胞存在多方面、多層次的缺陷。(2)原發(fā)性血小板增多癥患者BM-MSCs存在多種生物學特性異常，包括增殖能力增強、多向分化能力異常（不易向成骨細胞方向分化）、細胞凋亡減少。(3)原發(fā)性血小板增多癥患者BM-MSCs支持造血能力（尤其支持長期造血能力和巨核細胞系造血能力）減弱。(4)原發(fā)性血小板增多癥患者BM-MSCs抑制正常來源的外周血單個核細胞增殖能力減弱，但可促進外周血單個核細胞向調(diào)節(jié)性T細胞分化。(5) IFNα-2b可