特異氨基酸位點(diǎn)對(duì)Vip3Aa18殺蟲(chóng)功能的影響.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, 簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)是應(yīng)用最成功最廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑,但近年來(lái)抗性問(wèn)題卻嚴(yán)重影響了Bt的應(yīng)用和發(fā)展。營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白(vegetative insecticidal protein, 簡(jiǎn)稱(chēng)VIPs)是一種全新的殺蟲(chóng)物質(zhì),與任何已知的殺蟲(chóng)晶體蛋白沒(méi)有同源性,其殺蟲(chóng)機(jī)理也不同于已知的殺蟲(chóng)晶體蛋白。VIPs蛋白單獨(dú)或是與Cry蛋白共同使用,或是組建融合基因構(gòu)建工程菌,都將極大地?cái)U(kuò)大Bt的殺蟲(chóng)

2、譜、提高毒力,同時(shí)還可以抑制害蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生。 本文以本實(shí)驗(yàn)室提交到GenBank的vip3Aa18基因及其構(gòu)建菌株為實(shí)驗(yàn)材料,運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析了Vip3Aa18蛋白的二硫鍵位點(diǎn)、結(jié)合域、蛋白酶水解位點(diǎn)等位點(diǎn)和功能區(qū)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Vip3Aa18蛋白的第292位和401位的半胱氨酸能形成一個(gè)二硫鍵；C端(Aa539-Aa666)位置存在一個(gè)糖結(jié)合域；198和455位的蛋白酶水解位點(diǎn)可能與形成毒性核心片段有關(guān)。用定點(diǎn)突變技術(shù)

3、構(gòu)建了相應(yīng)氨基酸位點(diǎn)的突變菌株：與二硫鍵有關(guān)的C401G、C507G、C401G&C507G突變菌株,與結(jié)合域有關(guān)的N555I、T570I、T570S、Y616A、Y629S、D660G突變菌株,與蛋白酶水解位點(diǎn)有關(guān)的K198D、K455N、K198D&K455N突變菌株(數(shù)字代表Vip3Aa18上突變的氨基酸位點(diǎn),突變后位點(diǎn)前面的氨基酸變?yōu)楹笳?。將突變菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并用甜菜夜蛾進(jìn)行生物活性測(cè)定,與原始Vip3Aa18菌株的殺蟲(chóng)毒

4、力進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1.在Vip3Aal8內(nèi)共有三個(gè)半胱氨酸(292位、401位、507位),軟件預(yù)測(cè)292&401位能形成一個(gè)二硫鍵。生物活性測(cè)定顯示C401G和C401G&C507G菌株對(duì)甜菜夜蛾幾乎完全失去了殺蟲(chóng)活性,而C507G菌株的殺蟲(chóng)活性和原始Vip3Aal8菌株沒(méi)有顯著差異。生物活性測(cè)定結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果相符。所以,我們認(rèn)為Vip3Aa18蛋白的292&401位能形成二硫鍵,并且二硫鍵在維持Vip3Aa18蛋白

5、的高級(jí)結(jié)構(gòu)及其毒性方面非常重要。 2.結(jié)合域內(nèi)的T570I、T570S、Y629S、D660G突變菌株對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲(chóng)活性也幾乎完全丟失,而N555I和Y616A突變菌株的殺蟲(chóng)毒力與原始Vip3Aal8菌株基本相同,說(shuō)明Vip3Aa18蛋白的570位、629位和660位氨基酸是結(jié)合域內(nèi)的關(guān)鍵位點(diǎn),在Vip3Aa18蛋白對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲(chóng)作用中扮演了重要角色。 3.軟件預(yù)測(cè)Vip3Aal8蛋白的198位和455位是潛在的蛋白

6、酶水解位點(diǎn),兩個(gè)位點(diǎn)正常水解后能形成毒性核心片段,若不正常水解可能影響Vip3Aal8的殺蟲(chóng)活性,但生物活性測(cè)定結(jié)果顯示K198D、K455N及K198D&K455N突變菌株對(duì)甜菜夜蛾的殺蟲(chóng)毒力與原始Vip3Aal8菌株相比均沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明這兩個(gè)水解位點(diǎn)的突變并不影響Vip3Aal8菌株的殺蟲(chóng)活性。在198位和455位附近還有其它水解位點(diǎn),能影響殺蟲(chóng)活性的水解位點(diǎn)可能在它們附近。 本研究首次確定了二硫鍵的位置并證實(shí)了其對(duì)V