缺血再灌注損傷對皮瓣細胞凋亡及相關基因bcl-2表達的影響.pdf

1、目的：應用分子生物學及免疫組化方法，研究皮瓣組織缺血再灌注(ischemia-reperfusion I/R)損傷不同時間點細胞凋亡及相關基因bcl-2表達的變化規(guī)律，探討缺血再灌注損傷對皮瓣組織細胞凋亡及相關基因bcl-2表達的影響，為臨床上減輕直至消除皮瓣組織缺血再灌注損傷、提高皮瓣移植成活率，從調(diào)控細胞凋亡角度開辟新的治療途徑。 方法：1、實驗動物：雄性健康Wister大鼠40只，稱重，編號。2、實驗動物分組：將大鼠隨機分

2、為五組，即對照組(Ⅰ組)、再灌注2小時組(Ⅱ組)、再灌注6小時組(Ⅲ組)、再灌注12小時組(Ⅳ組)和再灌注24小時組(Ⅴ組)，每組8只。3、皮瓣制備方法：2％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉，每3小時追加一次(20mg/kg)以維持麻醉，大鼠仰臥，四肢固定，剪除腹毛，75％酒精消毒，按照PetryJJ等描述的方法，于右下腹設計一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小為6cm×3cm。Ⅰ組：按上述方法制備皮瓣，皮瓣形成后原位縫合，不做其

3、他處理：Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組：按上述方法制備皮瓣，皮瓣形成后，用微血管夾夾閉腹壁淺動脈發(fā)出點近端的股動脈，8小時后手術去除血管夾。4、取材：Ⅰ組在皮瓣形成后即刻于皮瓣中段邊緣取全層皮瓣組織2cm×1cm；Ⅱ組于再灌注后2小時用同樣方法取材；Ⅲ組于再灌注后6小時取材；Ⅳ組于再灌注后12小時取材；V組于再灌注后24小時取材。將所取組織一部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，及時制成石蠟切片，待做免疫組化染色和細胞凋亡原位末端標記；將另一部分組織

4、(約100mg)于-80℃冰箱保存，備Bcl-2 mRNA檢測。5、檢測方法及指標：(1)凋亡細胞原位末端標記(TUNEL法)與半定量分析：對皮瓣組織石蠟切片采用TUNEL法原位標記DNA片段檢測凋亡細胞，操作方法嚴格按照說明書進行，光鏡下觀察凋亡細胞的分布，陽性細胞可見細胞核呈棕黃色。根據(jù)凋亡陽性細胞分布情況，每張切片于40倍目鏡下隨機拍攝5個陽性視野，每視野記數(shù)300個細胞中陽性細胞數(shù)，計數(shù)凋亡細胞數(shù)目及總細胞數(shù)目，以陽性細胞數(shù)所占

5、總細胞數(shù)的百分比作為凋亡細胞陽性指數(shù)(AI，AI=凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100％)。(2)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應法(reverse transcription，RT-PCR)半定量檢測Bcl-2 mRNA水平：依據(jù)文獻報道設計引物，由上海生物工程公司合成。引物序列：Bcl-2上游引物：5’-CAAGAATGCAAAGCACATCC-3’，Bcl-2下游引物：5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’。β-actin上游引物：5

6、’-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3’，β-actin下游引物：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。按Trizol RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，RNA保存在-80℃，用紫外分光光度吸收法測定RNA的含量。然后進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增反應，Bcl-2 mRNA的相對含量用β-actin條帶灰度值標化后的Bcl-2條帶灰度值表示。(3)免疫組化檢測及評分：對石蠟切片進行SP法免疫組化染色，步驟嚴格按照

7、試劑盒說明書進行，光鏡下觀察Bcl-2蛋白的分布和著色深淺程度，陽性與陰性對照同時進行，陽性信號以胞質(zhì)或胞膜有棕黃色或棕褐色顆粒為判斷。免疫組化評分(immunohistochemicalscores IHS)方法參照文獻，結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分：a為陽性細胞百分比(無陽性細胞=0，陽性細胞占1-10％=1，11-50％=2，51-80％=3，81-100％=4)，b為陽性細胞染色強弱(陰性=0，弱陽性=1，中

8、度陽性=2，強陽性=3)，a，b兩項乘積即為該例組織的IHS。6、統(tǒng)計學處理：用SAS6.12統(tǒng)計學處理軟件，對不同類型數(shù)據(jù)進行不同的統(tǒng)計學處理。 結果：1、TUNEL法觀察細胞調(diào)亡情況：光鏡下觀察，TUNEL標記DAB染色的陽性細胞主要位于皮瓣組織的上皮基底層細胞、成纖維細胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管壁細胞中，皮下結締組織中也可見少量，染色主要位于胞核，呈棕黃色。其中Ⅰ組僅可見少量、散在的陽性細胞；Ⅱ組～Ⅴ組陽性細胞均較Ⅰ組明

9、顯增多，且Ⅱ組～Ⅴ組的TUNEL陽性細胞表達呈逐漸增強的趨勢。Ⅰ～Ⅴ組的AI分別為：(17.32±0.97)％、 (24.51±1.64)％、 (30.69±2.14)％、(35.42±2.3 1)％和(39.95±2.47)％，Ⅱ組～Ⅴ組與Ⅰ組比較差異顯著(P＜0.05)，且Ⅱ組～Ⅴ組的AI關系為：Ⅱ組＜Ⅲ組＜Ⅳ組＜Ⅴ組(P均＜0.05)。2、RT-PCR法測Bcl-2mRNA水平：PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠成像系統(tǒng)自

10、動掃描，測各條帶吸光度(A)，以目的基因A與β-actin A的比值代表目的基因的相對表達量，Ⅰ～Ⅴ組的Bcl-2相對表達量分別為：(0.177±0.011)、(0.293±0.023)、(0.389±0.027)、 (0.507±0.036)和(0.403±0.031)。Ⅱ組～Ⅳ組較Ⅰ組表達明顯增強(P＜0.05)，Ⅱ組～Ⅳ組的表達關系為：Ⅱ組＜Ⅲ組＜Ⅳ組(P均＜0.05)：Ⅴ組較Ⅰ組表達明顯增強(P＜0.05)，但與Ⅳ組比較，表達減

11、弱(P＜0.05)。 3、免疫組化結果：光鏡下觀察，Bcl-2陽性細胞主要分布于皮瓣組織的上皮基底層細胞、成纖維細胞、毛囊、汗腺、皮脂腺及血管壁細胞中，與凋亡細胞的集中分布基本一致。染色主要位于胞漿，呈棕黃色或棕褐色。I～V組的Bcl-2陽性細胞IHS分別為：(1.34±0.12)、(4.73±0.25)、(7.19±0.48)、 (9.62±0.71)、 (7.33±0.5 1)。II組～V組較I組表達均明顯增強(P＜0.05)，II