皮瓣缺血再灌注損傷對皮瓣細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡基因FAS表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察皮瓣組織發(fā)生缺血再灌注后形態(tài)學(xué)的變化;對比研究皮瓣組織缺血再灌注組與非缺血再灌注組細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律；對比研究缺血再灌注組與非缺血再灌注組的皮瓣組織不同時(shí)間點(diǎn)Fas蛋白的表達(dá)情況；對比研究缺血再灌注組與非缺血再灌注組的皮瓣組織在不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)凋亡基因Fas的表達(dá)情況。以闡明Fas基因在皮瓣缺血再灌注中的作用，探討缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡與Fas基因的關(guān)系，為從基因水平，防治皮瓣缺血再灌注損傷，提高皮瓣成活率，提供新思路和理論依

2、據(jù)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康清潔級(jí)WISTAR大鼠50只，稱重、編號(hào)。
　　 2.動(dòng)物模型建立：于皮瓣制作前三天，各組大鼠用8％的硫化鈉腹部脫毛備皮（面積為4×10cm2），溫水沖洗后自然晾干。以3％戊巴比妥鈉（40mg/Kg體重）腹腔注射麻醉，每3小時(shí)追加麻醉一次（20mg/Kg體重）以維持麻醉。麻醉成功后大鼠仰臥位，四肢固定，75％酒精消毒，于右下腹設(shè)計(jì)一以腹壁淺血管為蒂的軸形皮瓣，大小約

3、3 cm×6 cm。
　　 3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將大鼠分為兩組，(1)非-IR組25只：皮瓣形成后原位縫合，不做任何處理。時(shí)間點(diǎn)的選取以形成皮瓣后8h、9h、14h、20h、32h分為五組與實(shí)驗(yàn)組形成對照，每組五只大鼠。IR組25只：皮瓣形成后，微血管夾夾閉腹壁淺動(dòng)脈發(fā)出點(diǎn)近端的股動(dòng)脈，手術(shù)顯微鏡下觀察，確認(rèn)血流阻斷后，3-0絲線原位縫合皮瓣，切口再次消毒。8h后再次手術(shù)去除血管夾，并經(jīng)手術(shù)顯微鏡下觀察，確認(rèn)恢復(fù)血流，再灌注成功。

4、按去除動(dòng)脈夾血管再灌注后0h、1h、6h、12h、24h分為五組，每組五只大鼠。
　　 4.取材：非-IR組和IR組按照各組時(shí)間點(diǎn)的要求，分別于皮瓣中間邊緣處取皮瓣組織1.0cm×0.5cm，所取標(biāo)本中一部分用多聚甲醛迅速固定待做石蠟切片及免疫組化染色，準(zhǔn)備做細(xì)胞凋亡和Fas的檢測。部分液氮冰凍后，置冰箱中保存，以備RT-PCR檢測。
　　 5.檢測方法及觀測指標(biāo)
　　 5.1 組織學(xué)檢查：將石蠟切片進(jìn)行HE染色

5、，觀察組織結(jié)構(gòu)改變。
　　 5.2 凋亡細(xì)胞原位末端標(biāo)記（TUNEL法）檢測：應(yīng)用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測皮瓣組織不同時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞陽性指數(shù)用平均陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值表示(AI，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100％)。
　　 5.3 Fas基因蛋白表達(dá)檢測：應(yīng)用免疫組化(SP)法檢測皮瓣組織中凋亡細(xì)胞在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)Fas蛋白表達(dá)。用計(jì)算機(jī)圖象分析系統(tǒng)分析單位面積下陽性細(xì)胞的平均灰度值，分別

6、取其平均值表示該切片F(xiàn)as蛋白表達(dá)的情況。
　　 5.4 Fas mRNA表達(dá)檢測：應(yīng)用RT-PCR檢測皮瓣組織中Fas基因表達(dá)在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化規(guī)律。用凝膠圖象分析系統(tǒng)（武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)HMIAS-2000型）對目的電泳條帶進(jìn)行分析，以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照，結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（（X）±S）表示，采用SPSS16軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，顯著性分析以P

7、＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE染色觀測結(jié)果： IR組較非-IR組比較，皮下水腫較明顯，皮膚各層結(jié)構(gòu)紊亂、疏松、有大量的炎性細(xì)胞聚集、粘附于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，微血管管壁損傷，完整性破壞，有大量炎性細(xì)胞滲出到組織間隙，部分紅細(xì)胞堆積在毛細(xì)血管和微靜脈周圍。
　　 2.TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡：應(yīng)用TUNEL法對皮瓣組織的凋亡細(xì)胞檢測，發(fā)現(xiàn)IR組及非-IR組均發(fā)生細(xì)胞凋亡，陽性細(xì)胞主要位于

8、表皮層，皮下組織偶可見散在陽性細(xì)胞。IR組明顯高于非-IR組(P＜0.05)。
　　 3.Fas蛋白的表達(dá)：本實(shí)驗(yàn)觀測到，在非-IR組中皮瓣組織Fas蛋白表達(dá)為弱陽性平均灰度值在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 IR隨著缺血和再灌注時(shí)間的增加，F(xiàn)as蛋白表達(dá)急速上升，到再灌注后12h達(dá)到了高峰，陽性細(xì)胞可連成線片狀，染色最深，24h表達(dá)減弱。非-IR組與IR組通過SPSS分析有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 4.Fas

9、 mRNA的表達(dá)：應(yīng)用RT-PCR法發(fā)現(xiàn)在非-IR組中皮瓣組織Fas基因表達(dá)弱陽性，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 IR組隨著缺血再灌注時(shí)間延長，F(xiàn)as基因表達(dá)水平程增高趨勢，到再灌注后12h達(dá)到高峰，IR24h組較IR12h組表達(dá)減弱。非-IR組與IR組通過SPSS分析有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.皮瓣缺血再灌注損傷后可加速細(xì)胞凋亡。
　　 2.皮瓣組織缺血再灌注損傷時(shí)，