DDR2調(diào)控MMP-13表達的分子機制及其與類風濕性關節(jié)炎關節(jié)軟骨破壞關系的研究.pdf

1、DDR2(DiscoidinDomainReceptor2)屬于受體型蛋白酪氨酸激酶，其配體為天然纖維型膠原(I,II和III型)。膠原與DDR2的結(jié)合能使其發(fā)生酪氨酸磷酸化，從而介導其下游的信號轉(zhuǎn)導。我們實驗室已有的研究表明，DDR2在體外培養(yǎng)的RA成纖維樣滑膜細胞中高表達。RA的主要病理特征為血管翳的形成和滑膜組織的過度增殖并貼附于關節(jié)軟骨，而關節(jié)軟骨的主要膠原成份為II型膠原，這就為DDR2與其配體的結(jié)合并介導相關信號轉(zhuǎn)導過程提供

2、了空間上的可能。由于DDR2的主要功能是增加細胞中MMPs的表達。因此，我們認為在RA病人的關節(jié)中可能存在這樣的病理過程：異常的炎癥反應和滑膜功能的異常上調(diào)了滑膜細胞中DDR2的表達水平，同時滑膜的過度增殖為DDR2與膠原配體的相互作用提供了生理基礎，使DDR2發(fā)生持續(xù)活化并過分泌MMPs侵蝕破壞軟骨結(jié)構。
　　在MMPs家族成員中，膠原酶是天然膠原降解的限速酶。RA滑膜細胞主要分泌膠原酶1(MMP-1)和膠原酶3(MMP-13)

3、。而MMP-13對II型膠原的降解能力是MMP-1的5～10倍，此外，MMP-13還能降解關節(jié)軟骨中的蛋白聚糖。因此，DDR2是否調(diào)控RA滑膜細胞過表達MMP-13及其調(diào)控機制成為本研究的出發(fā)點。
　　我們首先體外分離了RA滑膜組織，經(jīng)原代培養(yǎng)生長至四代的成纖維樣滑膜胞用于實驗。以II型膠原刺激RA滑膜細胞48小時后，收集細胞并分別分析MMP-13和MMP-1的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示，II型膠原刺激同時上調(diào)MM-1和MM

4、P-13的mRNA和蛋白水平，然而，MMP-13被上調(diào)的幅度顯著大于MMP-1，前者mRNA上調(diào)了8倍左右，而后者只上調(diào)了兩倍。提示，II型膠原主要誘導滑膜細胞表達MMP-13。進一步通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的方式，在小鼠成纖維樣滑膜細胞中過表達DDR2，顯著增加了滑膜細胞中II型膠原誘導的MMP-13的表達水平，明確了DDR2與MMP-13在滑膜細胞中表達的相關性。
　　與原代RA滑膜細胞相比，永生化的RA滑膜細胞系MH7A幾乎失去受

5、II型膠原誘導表達MMP-13的能力。而根據(jù)文獻報道，此細胞系與原代培養(yǎng)的RA滑膜細胞主要的表型差別是，細胞中ERKMAPK的組成型活化和細胞增殖速率的增加。據(jù)此，我們分析ERKMAPK可能參與了RA滑膜細胞中II型膠原誘導的MMP-13的表達。進一步用研究發(fā)現(xiàn)，ERKMAPK通路的特異性抑制劑PD98059能阻斷DDR2誘導的MMP-13的表達和轉(zhuǎn)錄。此外，過表達DDR2顯著增加了細胞中ERKMAPK的磷酸化水平，上述實驗證據(jù)充分說明

6、了ERKMAPK為DDR2下游的信號轉(zhuǎn)導分子之一，并參與誘導MMP-13的表達。
　　為了進一步探索DDR2介導MMP-13表達的分子機制，我們構建了MMP-13啟動子報告基因，發(fā)現(xiàn)過表達野生型和組成型活化的DDR2分子(將人IgG1Fc段與無信號肽的DDR2序列進行融合，并連入分泌型蛋白表達載體中)都能上調(diào)MMP-13啟動子報告基因的活性，且后者的調(diào)控活性強于前者，然而激酶區(qū)突變的DDR2分子則不具備這種調(diào)控作用，明確了DDR2

7、對MMP-13啟動子活性呈現(xiàn)活化依賴的上調(diào)作用。我們對MMP-13啟動子區(qū)序列進行截短突變分析，發(fā)現(xiàn)將近端的Runx-2結(jié)合位點突變后，啟動子報告基因失去了受DDR2誘導的活性，進一步共表達DDR2和Runx-2，發(fā)現(xiàn)它們能協(xié)同增加MMP-13的啟動子活性，提示Runx-2可能受DDR2活化的調(diào)控并參與MMP-13的轉(zhuǎn)錄。然而，Runx-2基因主要表達于成骨細胞和骨骼肌細胞中，是調(diào)控骨形成和骨骼肌功能的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。目前，還沒有Ru

8、nx-2在滑膜組織中表達的相關報道。我們通過免疫組織化學檢測到了Runx-2蛋白在RA滑膜組織的表達，發(fā)現(xiàn)RA炎癥條件下與軟骨相接觸的滑膜襯里層Runx-2表達水平較滑膜下層高，這與DDR2和MMP-13在RA滑膜組織中的表達模式一致。此外，在滑膜細胞中過表達Runx-2，顯著增加滑膜細胞中II型膠原誘導的MMP-13的表達。上述結(jié)果充分提示了Runx-2可能受DDR2活化的調(diào)控上調(diào)RA滑膜細胞中MMP-13的表達。
　　細胞表面

9、RTK的活性是受到嚴格的控制和調(diào)節(jié)的，這對于維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著非常重要的意義。Cbl家族的蛋白作為泛素連接酶E3能促進多種RTK偶聯(lián)泛素標簽并走向降解的途徑，是負向調(diào)控RTK功能的重要機制之一。那么，作為RTK的DDR2是否能受Cbl蛋白的泛素化調(diào)節(jié)呢？如果活化的DDR2可以被Cbl蛋白負向調(diào)控，那么這類泛素連接酶E3是否能降低滑膜細胞中DDR2介導的MMP-13的表達呢？基于上述疑問，我們首先檢測了Cbl和Cbl-b對DDR2泛素化水

10、平的影響。體內(nèi)體外泛素化實驗都顯示，Cbl-b能顯著增加活化DDR2的泛素化水平，而Cbl蛋白則不具備這種能力，并且Cbl-b對DDR2泛素化的調(diào)控依賴于其泛素連接酶的活性。脈沖追蹤實驗也顯示，Cbl-b對DDR2泛素化的調(diào)控使其走向了依賴蛋白酶體的降解途徑。為了明確Cbl-b對DDR2的泛素化調(diào)控是否降低滑膜細胞中膠原誘導的MMP-13的表達，我們分析了Cbl-b-/-小鼠滑膜細胞中II型膠原誘導的MMP-13表達量。結(jié)果顯示，Cbl