DDR2調(diào)控MMP-13表達(dá)的分子機(jī)制及其與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨破壞關(guān)系的研究.pdf

1、DDR2(DiscoidinDomainReceptor2)屬于受體型蛋白酪氨酸激酶，其配體為天然纖維型膠原(I,II和III型)。膠原與DDR2的結(jié)合能使其發(fā)生酪氨酸磷酸化，從而介導(dǎo)其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們實(shí)驗(yàn)室已有的研究表明，DDR2在體外培養(yǎng)的RA成纖維樣滑膜細(xì)胞中高表達(dá)。RA的主要病理特征為血管翳的形成和滑膜組織的過度增殖并貼附于關(guān)節(jié)軟骨，而關(guān)節(jié)軟骨的主要膠原成份為II型膠原，這就為DDR2與其配體的結(jié)合并介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程提供

2、了空間上的可能。由于DDR2的主要功能是增加細(xì)胞中MMPs的表達(dá)。因此，我們認(rèn)為在RA病人的關(guān)節(jié)中可能存在這樣的病理過程：異常的炎癥反應(yīng)和滑膜功能的異常上調(diào)了滑膜細(xì)胞中DDR2的表達(dá)水平，同時(shí)滑膜的過度增殖為DDR2與膠原配體的相互作用提供了生理基礎(chǔ)，使DDR2發(fā)生持續(xù)活化并過分泌MMPs侵蝕破壞軟骨結(jié)構(gòu)。
　　在MMPs家族成員中，膠原酶是天然膠原降解的限速酶。RA滑膜細(xì)胞主要分泌膠原酶1(MMP-1)和膠原酶3(MMP-13)

3、。而MMP-13對(duì)II型膠原的降解能力是MMP-1的5～10倍，此外，MMP-13還能降解關(guān)節(jié)軟骨中的蛋白聚糖。因此，DDR2是否調(diào)控RA滑膜細(xì)胞過表達(dá)MMP-13及其調(diào)控機(jī)制成為本研究的出發(fā)點(diǎn)。
　　我們首先體外分離了RA滑膜組織，經(jīng)原代培養(yǎng)生長至四代的成纖維樣滑膜胞用于實(shí)驗(yàn)。以II型膠原刺激RA滑膜細(xì)胞48小時(shí)后，收集細(xì)胞并分別分析MMP-13和MMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，II型膠原刺激同時(shí)上調(diào)MM-1和MM

4、P-13的mRNA和蛋白水平，然而，MMP-13被上調(diào)的幅度顯著大于MMP-1，前者mRNA上調(diào)了8倍左右，而后者只上調(diào)了兩倍。提示，II型膠原主要誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞表達(dá)MMP-13。進(jìn)一步通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方式，在小鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞中過表達(dá)DDR2，顯著增加了滑膜細(xì)胞中II型膠原誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)水平，明確了DDR2與MMP-13在滑膜細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)性。
　　與原代RA滑膜細(xì)胞相比，永生化的RA滑膜細(xì)胞系MH7A幾乎失去受

5、II型膠原誘導(dǎo)表達(dá)MMP-13的能力。而根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，此細(xì)胞系與原代培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞主要的表型差別是，細(xì)胞中ERKMAPK的組成型活化和細(xì)胞增殖速率的增加。據(jù)此，我們分析ERKMAPK可能參與了RA滑膜細(xì)胞中II型膠原誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)。進(jìn)一步用研究發(fā)現(xiàn)，ERKMAPK通路的特異性抑制劑PD98059能阻斷DDR2誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。此外，過表達(dá)DDR2顯著增加了細(xì)胞中ERKMAPK的磷酸化水平，上述實(shí)驗(yàn)證據(jù)充分說明

6、了ERKMAPK為DDR2下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，并參與誘導(dǎo)MMP-13的表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步探索DDR2介導(dǎo)MMP-13表達(dá)的分子機(jī)制，我們構(gòu)建了MMP-13啟動(dòng)子報(bào)告基因，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)野生型和組成型活化的DDR2分子(將人IgG1Fc段與無信號(hào)肽的DDR2序列進(jìn)行融合，并連入分泌型蛋白表達(dá)載體中)都能上調(diào)MMP-13啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性，且后者的調(diào)控活性強(qiáng)于前者，然而激酶區(qū)突變的DDR2分子則不具備這種調(diào)控作用，明確了DDR2

7、對(duì)MMP-13啟動(dòng)子活性呈現(xiàn)活化依賴的上調(diào)作用。我們對(duì)MMP-13啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行截短突變分析，發(fā)現(xiàn)將近端的Runx-2結(jié)合位點(diǎn)突變后，啟動(dòng)子報(bào)告基因失去了受DDR2誘導(dǎo)的活性，進(jìn)一步共表達(dá)DDR2和Runx-2，發(fā)現(xiàn)它們能協(xié)同增加MMP-13的啟動(dòng)子活性，提示Runx-2可能受DDR2活化的調(diào)控并參與MMP-13的轉(zhuǎn)錄。然而，Runx-2基因主要表達(dá)于成骨細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中，是調(diào)控骨形成和骨骼肌功能的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。目前，還沒有Ru

8、nx-2在滑膜組織中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。我們通過免疫組織化學(xué)檢測到了Runx-2蛋白在RA滑膜組織的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA炎癥條件下與軟骨相接觸的滑膜襯里層Runx-2表達(dá)水平較滑膜下層高，這與DDR2和MMP-13在RA滑膜組織中的表達(dá)模式一致。此外，在滑膜細(xì)胞中過表達(dá)Runx-2，顯著增加滑膜細(xì)胞中II型膠原誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)。上述結(jié)果充分提示了Runx-2可能受DDR2活化的調(diào)控上調(diào)RA滑膜細(xì)胞中MMP-13的表達(dá)。
　　細(xì)胞表面

9、RTK的活性是受到嚴(yán)格的控制和調(diào)節(jié)的，這對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著非常重要的意義。Cbl家族的蛋白作為泛素連接酶E3能促進(jìn)多種RTK偶聯(lián)泛素標(biāo)簽并走向降解的途徑，是負(fù)向調(diào)控RTK功能的重要機(jī)制之一。那么，作為RTK的DDR2是否能受Cbl蛋白的泛素化調(diào)節(jié)呢？如果活化的DDR2可以被Cbl蛋白負(fù)向調(diào)控，那么這類泛素連接酶E3是否能降低滑膜細(xì)胞中DDR2介導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)呢？基于上述疑問，我們首先檢測了Cbl和Cbl-b對(duì)DDR2泛素化水

10、平的影響。體內(nèi)體外泛素化實(shí)驗(yàn)都顯示，Cbl-b能顯著增加活化DDR2的泛素化水平，而Cbl蛋白則不具備這種能力，并且Cbl-b對(duì)DDR2泛素化的調(diào)控依賴于其泛素連接酶的活性。脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)也顯示，Cbl-b對(duì)DDR2泛素化的調(diào)控使其走向了依賴蛋白酶體的降解途徑。為了明確Cbl-b對(duì)DDR2的泛素化調(diào)控是否降低滑膜細(xì)胞中膠原誘導(dǎo)的MMP-13的表達(dá)，我們分析了Cbl-b-/-小鼠滑膜細(xì)胞中II型膠原誘導(dǎo)的MMP-13表達(dá)量。結(jié)果顯示，Cbl