過量碘致小鼠甲狀腺膠質潴留機理研究及干預性功能食品研制.pdf

1、背景與目的:
　　甲狀腺膠質潴留是指甲狀腺濾泡中膠質（I-，T3、T4）合成過多，轉運受阻的一種病態(tài)現(xiàn)象，是高碘性甲狀腺腫常見的病理特征。甲狀腺膠質潴留的發(fā)生機理與諸多原因有關，其中碘攝入水平被認為是最重要的影響因素。至今為止碘過量引起的作為甲狀腺腫大病理特征的甲狀腺膠質潴留的發(fā)生機制尚不清楚，隨著其發(fā)病率逐年升高，近年來引起了高度重視。
　　甲狀腺膠質潴留是一個復雜的過程，涉及多個環(huán)節(jié)，如碘攝入與轉運、碘離子活化、酪氨酸殘

2、基的碘化和縮合作用、甲狀腺膠質合成與儲存、甲狀腺膠質的釋放、甲狀腺球蛋白水解以及甲狀腺激素轉運等過程。以上過程緊密有序聯(lián)系，共同調節(jié)甲狀腺膠質合成、釋放及轉運，只要其中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生異常都可能導致甲狀腺膠質潴留發(fā)生。并且，若機體下丘腦—垂體—甲狀腺軸甲狀腺激素反饋作用失調也可加重甲狀腺膠質潴留。然而，究竟是哪些關鍵環(huán)節(jié)及關鍵基因發(fā)生異常導致甲狀腺膠質潴留的發(fā)生，以及下丘腦—垂體—甲狀腺軸在甲狀腺膠質潴留的發(fā)生過程中如何發(fā)揮其調節(jié)機制，

3、目前都尚缺乏研究。甲狀腺膠質潴留是高碘性甲狀腺腫常見的病理特征，全面認識甲狀腺膠質潴留的發(fā)生過程及機制將有利于揭示高碘性甲狀腺腫的發(fā)生機理。
　　因此，本課題建立7個月小鼠過量碘模型，研究甲狀腺膠質合成、釋放與轉運涉及的多個環(huán)節(jié)及相關調控基因，結合甲狀腺激素反饋機制，通過形態(tài)學方法和分子生物學方法從源頭開始探討長期過量碘致甲狀腺腫大病理特征甲狀腺膠質潴留的發(fā)生機制，為進一步闡明高碘性甲狀腺腫大機理提供有價值的資料。
　　同時

4、，本課題除了研究過量碘致小鼠甲狀腺膠質潴留的機理，還進行了相關干預性功能食品的研制。已有研究表明，過量碘能降低甲狀腺及血液抗氧化水平，引起氧化應激，造成甲狀腺功能損傷，是甲狀腺膠質潴留發(fā)生的可能機制，通過補充硒、維生素C、維生素E等抗氧化物質可改善機體抗氧化水平。因此，研制富含抗氧化因子的功能食品，從食品治療角度預防甲狀腺疾病，特別是對高碘性甲狀腺腫大將起到積極的防治作用。本研究選擇了抗氧化能力較高的馬尾松松針提取液為原料，進行馬尾松松

5、針提取液干預效果評價及馬尾松松針抗氧化酸奶加工工藝研究，為功能性酸奶的研發(fā)提供理論依據(jù)，從預防疾病的角度對過量碘造成的危害起到一定的積極防治作用。
　　方法:
　　1.實驗動物飼養(yǎng)及分組
　　1)第一批：剛斷乳的SPF級BALB/C雌性小鼠300只，體重15-17g，3-4周齡，健康狀況良好，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。環(huán)境溫度22±2℃，濕度40％-70%，照明時間12±3h。定期清潔動物房以及動物用籠具、飲水瓶。適

6、應性喂養(yǎng)1周后，按體重將動物隨機分成5組，每組60只，每組分別給予自來水及含不同劑量KIO3高碘水，連續(xù)喂養(yǎng)7個月。劑量及分組如下：A組（正常對照組）：自來水；B組（高碘1組）：1500μg/L；C組（高碘2組）：3000μg/L；D組（高碘3組）：6000μg/L；E組（高碘4組）：12000μg/L。飲水以KIO3配制成碘濃度為600mg/L的碘標準貯備溶液備用，各濃度的高碘水每周配制，小鼠自由飲水、飲食。飼料為廣東省醫(yī)學實驗動物中

7、心提供，飼料中的碘為365μg/kg。自來水中碘含量為8μg/L。
　　2)第二批：實驗動物的選擇，飼養(yǎng)環(huán)境同前。BALB/C雌性小鼠28，隨機分成4組，分別為空白組，高碘組，對照組，干預組，每組8只。采用自由飲水方式，空白組給予自來水，高碘組給予3000μg/L碘水，對照組經(jīng)口灌胃0.02ml/g馬尾松松針提取液后自由飲用自來水，干預組經(jīng)口灌胃0.2ml/g馬尾松松針提取液后自由飲用3000μg/L高碘水。連續(xù)喂養(yǎng)3個月后，進行

8、血清GSH-Px水平檢測，評估馬尾松松針提取液干預效果。
　　2.小鼠甲狀腺膠質潴留產(chǎn)生的檢測
　　7個月后測定甲狀腺臟器指數(shù)，病理切片下觀察甲狀腺組織變化，免疫組化分析甲狀腺球蛋白表達情況，利用放免試劑盒檢測血液TSH、FT4、FT3水平。
　　3.過量碘致小鼠甲狀腺膠質潴留作用機制的研究
　　1)尿碘測定：7個月后收集小鼠晨尿，利用尿碘試劑盒測定小鼠尿碘水平。
　　2)甲狀腺攝碘率測定：在當天上午，給全

9、部小鼠灌胃0.5 Mci I125，分別在灌胃后20min、2h時間點處死，摘取小鼠甲狀腺組織，稱重，用γ計算器分別測量20min、2h小鼠甲狀腺的放射性計數(shù)，本底計數(shù)，標準源計數(shù)，計算小鼠甲狀腺I125攝碘率。
　　3)甲狀腺基因測定：摘取小鼠甲狀腺組織及肝臟組織，用液氮迅速冷凍，-80℃保存?zhèn)溆?。qPCR法檢測甲狀腺組織中Tshr、Slc5a5（NIS)、Slc26a4（pendrin)、 Tpo、Duox2、Iyd、Ctsb

10、、Ctsd、Slc16a2（Mct8)的mRNA表達。
　　4)血清GPH-Px測定：7個月后收集小鼠血清，利用 GPH-Px試劑盒測定小鼠血清GPH-Px水平。
　　4.馬尾松松針提取液干預效果評估及其干預性功能食品加工工藝研究
　　通過檢測3個月小鼠血清GSH-Px水平，評價馬尾松松針提取液對過量碘危害的干預效果；通過單因素實驗，正交實驗法，感官評定，確定干預性功能食品馬尾松松針抗氧化酸奶的最佳工藝和配方。

11、　　結果:
　　1.過量碘致小鼠甲狀腺膠質潴留的產(chǎn)生
　　1)過量碘對小鼠甲狀腺臟器/體重指數(shù)的影響
　　從碘濃度為3000μg/L的C組開始，過量碘可致甲狀腺臟器/體重指數(shù)明顯升高，與正常組對比有顯著性差異（P<0.05），經(jīng)Spearman相關檢驗，小鼠甲狀腺臟器/體重指數(shù)與碘濃度呈顯著正相關（r=0.655，P=0.01）。
　　2)甲狀腺組織形態(tài)學觀察
　　光境下，可見正常對照組A組的甲狀腺濾泡中等

12、大小，呈圓形或橢圓形，濾泡上皮細胞多為單層立方狀或高柱狀。各高碘組的甲狀腺濾泡明顯增大，濾泡腔內充滿紅色膠質，上皮細胞呈扁平狀。高劑量組濾泡有融合現(xiàn)象。隨著碘濃度的升高，甲狀腺膠質潴留現(xiàn)象越來越明顯。
　　3)免疫組化檢測甲狀腺組織中Tg蛋白的表達情況
　　免疫組化分析顯示正常對照組A組Tg有基礎表達，D、E組Tg在甲狀腺濾泡腔中表達的范圍和強度較對照組明顯增強。
　　4)過量碘對小鼠血清甲狀腺激素水平的影響
　

13、　從碘濃度為3000μg/L的C組開始，血清TSH水平升高與對照組相比有顯著性差異（P<0.05）；與正常組對比，所有實驗組血清FT4水平升高與FT3水平降低有顯著性差異（P<0.05）；經(jīng)Spearman相關檢驗，碘濃度與小鼠血清TSH呈顯著正相關（r=0.439，P=0.001），與血清FT4呈顯著正相關（r=0.649，P=0.000），與血清FT3呈顯著負相關（r=-0.320，P=0.03）。
　　2.過量碘致小鼠甲狀腺

14、膠質潴留作用機制的研究
　　1)過量碘對小鼠尿碘水平的影響
　　從碘濃度為1500μg/L的B組開始，小鼠尿碘水平與正常組相比明顯升高，差異有顯著性意義（P<0.05）。經(jīng) Spearman相關檢驗，小鼠尿碘水平與碘濃度呈顯著正相關（r=0.878，P=0.000）。
　　2)過量碘對小鼠甲狀腺攝碘率的影響
　　灌胃20min后，與正常對照組相比，從碘濃度為3000μg/L的C組開始小鼠甲狀腺攝碘率明顯降低，差異

15、有顯著性意義（P<0.05）。灌胃2h后，與正常對照組A組相比，從碘濃度為1500μg/L的B組開始小鼠甲狀腺攝碘率明顯降低，差異有顯著性意義（P<0.001)。
　　3)過量碘對甲狀腺Tshr、Slc5a5（NIS)、Slc26a4（pendrin)、Tpo、Duox2、Iyd、Ctsb、Ctsd、Slc16a2（Mct8) mRNA表達水平的影響
　　過量碘明顯抑制了Tshr、NIS、Pendrin，Tpo、Duox2

16、mRNA的表達，下調嚴重程度依次為 NIS、Pendrin、TPO、Tshr、Duox2，表達有顯著差異（P<0.05）；而Iyd、Cstb、Cstd mRNA表達雖然有下降，但表達無顯著差異（P＞0.05），對于Mct8基因，只有碘濃度為6000μg/L的D組Mct8 mRNA表達下調，表達有顯著差異（P<0.05）。
　　4)甲狀腺細胞結構受損及溶酶體數(shù)量減少
　　電鏡結果顯示，正常對照組甲狀腺濾泡上皮細胞結構清晰，細胞

17、核呈圓形或橢圓形，各種細胞器均勻分布于細胞質中，含有豐富的溶酶體。E組濾泡腔內充滿電子密度高的物質，可見膠質滴，甲狀腺甲狀腺濾泡上皮細胞扁平，核為長橢圓形，各種細胞器模糊不清，內質網(wǎng)極度擴張，脫顆粒，有的融合成不規(guī)則的囊泡，線粒體數(shù)目減少，空泡化，結構模糊，溶酶體罕見。與正常對照組對比，高劑量碘組能使甲狀腺甲狀腺濾泡上皮細胞的結構受損和溶酶體數(shù)量明顯減少。
　　5)過量碘對小鼠血清GSH-Px活性的影響
　　與正常對照組A組

18、相比，從碘濃度為3000μg/L的C組開始小鼠血清GSH-Px活性水平明顯降低，有顯著性差異（P<0.05）。
　　3.馬尾松松針提取液干預效果評估及其干預性功能食品加工工藝研究
　　1)與高碘組相比，空白組、對照組、干預組小鼠血清GSH-Px活性水平明顯升高，有顯著性差異（P<0.05）。
　　2)馬尾松松針提取液最佳浸提工藝：料液比1:20（g/mL），浸提時間120 min，浸提溫度90℃；馬尾松松針提取液最佳酶

19、解澄清工藝：水浴溫度65℃，澄清時間2h，果膠酶濃度0.12%；馬尾松松針抗氧化酸奶的最佳配方：以松針提取液為溶劑，脫脂奶粉質量分數(shù)14%，蔗糖質量分數(shù)7%，穩(wěn)定劑明膠質量分數(shù)0.1%；馬尾松松針抗氧化酸奶最佳發(fā)酵工藝：復合發(fā)酵劑添加質量分數(shù)0.12%，發(fā)酵時間為8h，發(fā)酵溫度為43℃；馬尾松松針抗氧化酸奶總抗氧化能力為51.31（U/mL），具有較強抗氧化能力。
　　結論:
　　1.過量碘致甲狀腺膠質潴留是由甲狀腺膠質合成