PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白組學(xué)分析靶基因Chop的確定及誘導(dǎo)性表達c-myc細(xì)胞系的建立.pdf

1、本文對PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白組學(xué)分析靶基因Chop的確定及誘導(dǎo)性表達c--myc細(xì)胞系的建立進行了研究。本研究分為四個部分：
　　 第一部分：PTEN敲除小鼠前列腺癌模型的蛋白組學(xué)分析。
　　 目的：通過高通量的質(zhì)譜技術(shù)以及SILAC精確的計量技術(shù)，使蛋白組學(xué)能夠應(yīng)用于前列腺癌蛋白質(zhì)組的系統(tǒng)分析，明確在腫瘤進程中有意義的蛋白指標(biāo)。
　　 方法：使用精氨酸10、賴氨酸8標(biāo)記的SILAC培養(yǎng)液對PTEN敲

2、除小鼠前列腺癌細(xì)胞株進行培養(yǎng)。RIPA液對細(xì)胞進行裂解。正常組織、腫瘤標(biāo)本的石蠟切片及小鼠前列腺癌細(xì)胞系提取蛋白，胰蛋白酶消化，肽鏈的分離及液相質(zhì)譜分析，軟件數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：數(shù)據(jù)分析最終得到約2000種蛋白。其中腫瘤標(biāo)本中明顯上調(diào)蛋白占264種，明顯下調(diào)蛋白303種。PTEN敲除標(biāo)本中有關(guān)細(xì)胞粘附的蛋白表達上調(diào)（膠原蛋白、層粘連蛋白、整合素…）;有關(guān)蛋白質(zhì)運輸(RAB)上調(diào);調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的部分蛋白下調(diào)（MAPK7、胞裂蛋

3、白及組蛋白），有關(guān)未折疊蛋白反應(yīng)中的一系列基因下調(diào)。
　　 結(jié)論：利用SILAC技術(shù)的定量蛋白組學(xué)研究能夠精確地對比腫瘤組織與正常組織之間的蛋白水平差異，能夠更好地了解前列腺癌進展的分子生物學(xué)機制，為前列腺癌早期的生物學(xué)標(biāo)志物的篩選、尋找有效地靶向治療基因及對于前列腺癌治療效果進行有效的監(jiān)測建立了良好的基礎(chǔ)。
　　 第二部分：抑制PTEN表達后前列腺癌細(xì)胞22Rv1的變化。
　　 目的：結(jié)合蛋白組學(xué)分析結(jié)果，PT

4、EN基因的缺失可能會引起有關(guān)未折疊蛋白反應(yīng)的基因的改變，從而對細(xì)胞的增殖與凋亡產(chǎn)生影響。目前PTEN與未折疊蛋白反應(yīng)中有關(guān)凋亡的Chop基因之間的關(guān)系尚無有關(guān)報道。
　　 方法：實驗采用前列腺癌細(xì)胞株22Rv1，首先利用siRNA干擾技術(shù)沉默22Rv1細(xì)胞中的PTEN基因。MTT檢測22Rv1細(xì)胞沉默PTEN基因后的細(xì)胞活力。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。使用realtimePCR技術(shù)檢測未折疊蛋白反應(yīng)中Chop基因，觀察其隨著PTE

5、N基因沉默后的表達情況。利用WesternBlot檢測蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：抑制或沉默PTEN后前列腺癌細(xì)胞22Rv1的凋亡減少，細(xì)胞活力升高。 westernBlot可見p-AKT473表達水平降低。Realtime PCR可見未折疊蛋白反應(yīng)中的Chop基因mRNA水平下降，westernblot檢測后可見Chop基因隨PTEN的抑制而下調(diào)。
　　 結(jié)論：結(jié)合前期蛋白組學(xué)分析結(jié)果，抑制PTEN基因后可見未折疊蛋白

6、反應(yīng)中有關(guān)細(xì)胞凋亡的Chop基因下調(diào)，提示Chop基因可能在前列腺癌細(xì)胞的增殖及其凋亡中發(fā)揮作用。
　　 第三部分：Chop基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞生長和凋亡的影響。
　　 目的：Chop，又稱為gadd153(DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3)是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在應(yīng)激刺激下穩(wěn)態(tài)失衡所誘導(dǎo)高表達的基因。我們研究表明隨著PTEN的下調(diào)，Chop基因隨之下調(diào)。chop基因的表達與細(xì)胞凋亡有關(guān)，但是chop基因在前列腺癌細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡及增殖的關(guān)

7、聯(lián)還未被證實。
　　 方法：實驗采用前列腺癌細(xì)胞株22Rv1，通過siRNA沉默22Rv1細(xì)胞中的Chop基因，MTT檢測細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。利用攜帶Chop基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入22Rv1，48小時候利用WesternBlot檢測蛋白表達情況。同時MTT檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：⑴抑制或沉默Chop基因后前列腺癌細(xì)胞22Rv1細(xì)胞凋亡減少、細(xì)胞活力增多。過表達Chop基因后可見細(xì)胞活

8、力降低，細(xì)胞凋亡增加。⑵過表達Chop基因后可見pAkt473、Ki67表達降低。
　　 結(jié)論：我們的數(shù)據(jù)顯示抑制PTEN表達后chop基因表達減少，細(xì)胞凋亡隨之減少，細(xì)胞活力升高。過表達Chop后細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞活力降低。隨著Chop表達增多，pAkt473基因與Ki67基因表達顯著下降。證明了在Chop基因可能是引起細(xì)胞凋亡過程中的一重要因素，通過降低pAkt473的表達水平，Chop基因能夠促使細(xì)胞進入凋亡。同時，過表達

9、Chop基因可見Ki67基因表達下調(diào)，推測Chop基因可能與細(xì)胞增殖有關(guān)。
　　 第四部分：構(gòu)建出可誘導(dǎo)表達c-myc基因的22Rv1細(xì)胞系。
　　 目的：Myc已知可直接或間接調(diào)節(jié)眾多基因及途徑的轉(zhuǎn)錄過程。本實驗在此基礎(chǔ)上結(jié)合可調(diào)控基因治療的觀念與手段，采用四環(huán)素誘導(dǎo)表達的載體系統(tǒng)，創(chuàng)建可誘導(dǎo)表達c-myc基因的22Rv1前列腺癌細(xì)胞系。
　　 方法：實驗采用前列腺癌細(xì)胞株22Rv1，首先構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的攜帶調(diào)節(jié)