2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本文對轉膠蛋白Transgelin誘導人前列腺癌細胞系LNCαP凋亡和衰老進行了研究。本研究分為三個部分:
   第一部分:觀察轉膠蛋白對肌動蛋白更新的影響。
   目的:研究轉膠蛋白對肌動蛋白更新、細胞ROS水平的影響,并進一步觀察其對DNA損傷傳導途徑和細胞衰老的影響。
   方法:將轉膠蛋白轉染至人前列腺癌細胞株LNCaP,檢測細胞絲狀肌動蛋白(F-actin)和球狀肌動蛋白(G-actin)的變化,并檢測

2、細胞內ROS水平的變化。通過8-OH-dG、phospho-ATM和γH2AX免疫熒光染色觀察DNA損傷情況,進一步通過Westernblotting檢測DNA損傷傳導途徑ATM(Ataxia-Telangiectasia Mutated)-Chk2(checkpoint kinase2)-p53的變化。通過Heterochromatin proteinl(HP1)免疫熒光染色、western blotting和半乳糖苷酶細胞(β-ga

3、l)化學染色等方法,觀察外源性轉膠蛋白和內源性轉膠蛋白分別對LNCaP和MRC5細胞染色質重構及細胞衰老的影響。同時,通過SiRNA抑制人骨肉瘤細胞株U2OS內源性轉膠蛋白的表達,觀察細胞F-actin、G-actin的變化和ROS的變化。
   結果:轉染轉膠蛋白至LNCaP細胞后24h,細胞F-actin增加明顯,G-actin無明顯變化,細胞內ROS水平升高;轉染U2OS細胞Si-transgelin RNA48h后,轉膠

4、蛋白水平明顯下降,細胞F-actin下降,ROS水平下降。LNCaP轉染轉膠蛋白后,免疫熒光染色提示細胞核出現8-OH-dG陽性染色,phospho-ATM熒光強度增加及γH2AX簇集的增多。Western blotting提示ATM-Chk2-p53途徑的激活。HP1免疫熒光染色提示LNCaP細胞轉染轉膠蛋白后,細胞衰老相關的異染色質簇集(Senescence-associated heterochromatin Foci,SAHF)

5、增多,western blotting提示HP1γ表達水平上升較明顯,acetyl-H3表達下降。β-半乳糖苷酶細胞化學染色提示轉染轉膠蛋白36 h后,陽性細胞數增多。HP1免疫熒光染色和western blotting提示MRC5高代細胞轉膠蛋白表達量較低代細胞多,同時SAHF也較低代細胞多。低代MRC5細胞轉染轉膠蛋白后,β-半乳糖苷酶陽性細胞增加。
   結論:轉膠蛋白通過促進LNCaP細胞F-actin聚集,可使細胞發(fā)生

6、DNA氧化損傷和DNA斷裂,激活DNA損傷信號傳導通路。轉染轉膠蛋白使LNCaP細胞發(fā)生細胞衰老。內源性轉膠蛋白和MRC5細胞衰老有關,若使MRC5過度表達轉膠蛋白,可導致細胞衰老。
   第二部分:觀察轉膠蛋白和p53之間的相互作用。
   目的:研究轉染轉膠蛋白至LNCaP細胞后,p53的表達及其分布的變化,并且研究轉膠蛋白和p53之間的相互作用。
   方法:轉染轉膠蛋白至LNCaP細胞,在不同時間點提取全

7、細胞裂解產物和胞漿、胞核細胞裂解產物進行western blotting檢測p53表達情況,并使用轉膠蛋白和p53免疫熒光染色檢測p53分布情況。隨后,我們采用哺乳類細胞雙雜交和免疫共沉淀方法研究轉膠蛋白和p53蛋白之間的相互作用。
   結果:轉染轉膠蛋白后,Western blotting提示LNCaP細胞p53表達增加,磷酸化p53(Ser46)也相應增加;胞漿中p53增加,而胞核中p53變化不明顯。轉膠蛋白和p53雙免疫

8、熒光染色也提示胞漿中p53水平增加。哺乳類細胞(人前列腺癌PC-3細胞)雙雜交實驗提示轉膠蛋白和p53相互結合,免疫共沉淀實驗顯示外源性、內源性轉膠蛋白和p53分別在LNCaP細胞和BJ細胞(成纖維細胞)共沉淀。
   結論:轉染轉膠蛋白使LNCaP細胞p53表達增高,而且p53胞漿轉位增加。轉膠蛋白和p53在哺乳類細胞內相互作用,并穩(wěn)定p53蛋白。轉膠蛋白和p53免疫共沉淀。
   第三部分:轉膠蛋白對p53下游基因及

9、內源性凋亡途徑的影響。
   目的:研究轉膠蛋白對p53下游基因表達的影響,以及轉膠蛋白誘導LNCaP細胞凋亡的機理。
   方法:轉染轉膠蛋白至LNCaP細胞,在不同時間點收集細胞裂解產物,使用westernblotting檢測PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)、Bax、Bcl-2和caspase-3的表達情況,然后分別將轉膠蛋白轉染HCT116 p53-/-和p5

10、3+-+細胞株,westernblotting檢測p53下游PUMA的表達情況。最后,采用細胞計數、脫氧核苷酸末端轉移酶dUTP標記方法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)和流式細胞計數等方法觀察轉膠蛋白對LNCaP細胞凋亡的影響。
   結果:轉染轉膠蛋白后,LNCaP細胞促凋亡因子Bax和PUMA表達量升高,而抗凋亡因子Bcl

11、-2表達水平下降,caspase-3的表達上升。分別轉染轉膠蛋白至HCT116p53-/-和p53+/+細胞株,p53陰性細胞株PUMA無明顯變化;而p53陽性細胞株PUMA表達升高。細胞計數提示轉染轉膠蛋白后細胞活力下降,TUNEL染色提示轉膠蛋白導致TUNEL陽性細胞數量升高,而流式細胞計數亦提示轉染轉膠蛋白后早期細胞凋亡增多。
   結論:轉膠蛋白通過上調促凋亡因子(PUMA、Bax)及抑制抗凋亡因子Bcl-2誘導內源性凋

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