1型多聚ADP-核糖聚合酶在大鼠心肌缺血再灌注損傷中活性變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：
　　 目前減輕急性心肌梗死缺血性損傷的有效手段是盡早實(shí)施再灌注治療,而再灌注同時(shí)會(huì)增加心肌損傷,包括微血管損傷、心律失常以及心肌細(xì)胞壞死的擴(kuò)展。但關(guān)于心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷確切的細(xì)胞機(jī)制仍未被完全清晰地闡明,心肌血流的中斷和再恢復(fù)將觸發(fā)許多病理生理過(guò)程,其中作為多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)家族中最豐富的同工酶P

2、ARP-1的過(guò)度活化可能成為研究的關(guān)鍵,它或許是動(dòng)物模型再灌注過(guò)程中介導(dǎo)氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙和死亡的一個(gè)關(guān)鍵途徑。
　　 已知PARP-1涉及壞死性細(xì)胞死亡,這種死亡與細(xì)胞凋亡和自噬相比較,代表了一種更嚴(yán)重的細(xì)胞終結(jié)形式。廣泛的DNA損傷(活性氧如過(guò)氧亞硝酸鹽,羥基和超氧自由基)導(dǎo)致PARP過(guò)度活化從而消耗細(xì)胞內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotin amideadenine dinucleotide,NAD+)儲(chǔ)備,降低NA

3、D+水平并通過(guò)氧化磷酸化抑制三磷酸腺苷(adenosine triphos phate,ATP)的產(chǎn)生,導(dǎo)致壞死性細(xì)胞死亡。PARP過(guò)度活化所致的細(xì)胞壞死性死亡與缺血再灌注損傷中由PARP-1抑制或缺失所提供的顯著的細(xì)胞保護(hù)作用相一致,而缺血再灌注損傷主要以壞死性細(xì)胞死亡為特征。因此,壞死是一種普遍的死亡方式并且也能被調(diào)控,研究證實(shí)PARP-1在與壞死和炎癥相關(guān)的缺血再灌注損傷中起到至關(guān)重要的作用,因此,PARP抑制劑可使此類疾病明顯獲

4、益,目前少數(shù)PARP抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。最新研究顯示,自由基-介導(dǎo)的PARP活化作用并不僅限于心肌,循環(huán)白細(xì)胞同心肌細(xì)胞一樣在再灌注后同樣存在著PARP過(guò)度活化。
　　 在此背景下,本研究旨在探討循環(huán)白細(xì)胞內(nèi)PARP激活能否作為再灌注心肌中PARP活化的一個(gè)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。為此,我們應(yīng)用大鼠首先測(cè)定PARP活化的終產(chǎn)物多聚ADP-核糖(poly(ADP-ribose),PAR)的含量,以明確心肌缺血再灌注損傷進(jìn)程中循環(huán)白細(xì)胞和再

5、灌注心肌中PARP活化情況。其次,我們進(jìn)一步明確循環(huán)白細(xì)胞內(nèi)PARP活化程度與心肌梗死范圍的關(guān)系。最后,我們探討PARP抑制劑3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)對(duì)PARP活性的作用及其在心肌缺血的在體模型中提供心肌保護(hù)的治療時(shí)間窗。
　　 目的：
　　 建立大鼠心臟I/R模型,檢測(cè)再灌注早期不同時(shí)點(diǎn)心肌和外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP-1活化產(chǎn)物PAR的表達(dá);同時(shí)測(cè)定心肌梗死范圍,探討外周血白細(xì)胞PA

6、RP-1活化與心肌PARP-1活化間的關(guān)系,及其與心肌損傷間的關(guān)系。最后,探討PARP抑制劑3-AB對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其有效給藥時(shí)間。
　　 方法：
　　 1、大鼠心臟I/R損傷模型的建立和分組
　　 采用開(kāi)胸結(jié)扎和松開(kāi)冠狀動(dòng)脈的方法建立大鼠心臟I/R損傷模型。大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,氣管切開(kāi)插管行小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸,呼吸頻率75次/min。在第四肋間行左胸廓切開(kāi)術(shù),暴露心臟,打開(kāi)心

7、包,擠出大部分心臟。暴露肺動(dòng)脈圓錐與左心耳根部間的左冠狀靜脈。以左冠狀靜脈為標(biāo)志,用5-0縫線在左冠狀靜脈下穿線,連同左冠狀靜脈一起在距冠狀動(dòng)脈前降支根部1-2mm形成一個(gè)直徑約5mm的活結(jié),將5mm聚乙烯軟管置于活結(jié)中。45min后拔出聚乙烯軟管,使冠狀動(dòng)脈血流再通,在整個(gè)缺血和再灌注過(guò)程中,一直監(jiān)測(cè)大鼠肛溫,通過(guò)熱摯和臺(tái)燈維持大鼠體溫在37-38℃。
　　 (1)缺血再灌注不同時(shí)點(diǎn)PAR在心肌以及外周血白細(xì)胞內(nèi)表達(dá),隨機(jī)分為

8、:sham組;I/R0min組;FR15min組;I/R2h組;I/R6h組;I/R24h組
　　 另設(shè)一組,通過(guò)輕微改變冠脈結(jié)扎位置來(lái)獲得一個(gè)較廣泛的心肌梗死范圍進(jìn)一步明確缺血再灌注不同時(shí)點(diǎn)外周血白細(xì)胞PARP-1活化與心肌損傷間的關(guān)系,隨機(jī)分為:I/R2h組;I/R6h組;I/R24h組
　　 (2)為明確PARP抑制劑3-AB對(duì)大鼠心肌缺血再灌注2h后心肌梗死范圍以及PARP活化的影響,隨機(jī)分組為假手術(shù)+生理鹽水組

9、、假手術(shù)+3-AB組、I/R2h+生理鹽水組、I/R2h+3-AB組,3-AB(20mg/kg,每2小時(shí),于再灌注前15分鐘iv.給藥)。
　　 為明確PARP抑制劑3-AB對(duì)大鼠心肌缺血再灌注24小時(shí)的心肌保護(hù)作用及其有效給藥時(shí)間,另設(shè)一組為I/R24h+生理鹽水組、I/R24h+3-AB組,3-AB(20mg/kg,分別于再灌注前15分鐘、再灌注后15分鐘、2小時(shí)、4小時(shí)iV.給藥)。
　　 2、外周血白細(xì)胞的準(zhǔn)備<

10、br>　　 抽取肝素化抗凝全血6ml,應(yīng)用單個(gè)核細(xì)胞分離液,采用密度梯度離心方法分離單個(gè)核細(xì)胞。將6mlHistopaque-1083置于離心管底部,輕移6ml抗凝全血至其頂部,室溫下以800g離心15分鐘,后用吸管抽吸血漿層至0.5cm厚包含單個(gè)核細(xì)胞的不透明層,收集分離的單個(gè)核細(xì)胞使用梯度降溫法于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　 3、心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)、梗死范圍檢測(cè)
　　 采用伊文氏蘭-氯化三苯基四氮唑(tripheny

11、ltetrazoliumchloride,TTC)染色檢測(cè)各組缺血危險(xiǎn)區(qū)(areaatrisk,AAR)及心肌梗死面積(infarctsize,IS)。再灌注結(jié)束時(shí),再次原位結(jié)扎冠狀動(dòng)脈,從左心室腔注入2%伊文氏蘭3ml,未缺血心肌組織染成藍(lán)色,缺血心肌不染色,即為缺血危險(xiǎn)區(qū)。剪去右心室和心房,凍存后切厚度為2mm的橫斷面切片4-5個(gè),缺血左室部分置于37℃下1%的TTC溶液中孵育20分鐘,染色后將心臟切片以10%甲醛溶液固定6h。三種

12、顏色(白,紅和藍(lán))分別代表梗死區(qū)、非梗死的缺血區(qū)和非缺血區(qū),非梗死的缺血區(qū)和梗死區(qū)一起作為缺血危險(xiǎn)區(qū)。缺血危險(xiǎn)區(qū)用缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌重量與左室重量之比(AAR/LV%)表示,而梗死區(qū)范圍用梗死區(qū)心肌重量與缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌重量之比(IS/AAR%)表示。
　　 4、WresternBlot以及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組心肌和外周血白細(xì)胞的PARP活化產(chǎn)物PAR表達(dá)。
　　 采用WesternBlot方法檢測(cè)各組心肌和外周血白細(xì)胞的

13、PAR表達(dá)。取組織或細(xì)胞勻漿液離心后應(yīng)用Bradford進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)。取蛋白20μL(50μg)上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞胺凝膠上,電泳電壓120V,轉(zhuǎn)膜后封閉,按照1:400稀釋PAR,1:2000稀釋?duì)?actin抗體37℃孵育1小時(shí),放入4℃冰箱過(guò)夜進(jìn)行一抗雜交,取相對(duì)應(yīng)二抗雜交,電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光,將膠片于成像系統(tǒng)中拍照,以QuantityOne4.6.2成像

14、軟件分析電泳帶的灰度值,以PAR目的片段(116kd)的灰度值與相應(yīng)的β-actin的灰度值的比值為各個(gè)樣本PAR表達(dá)量的比例。
　　 采用免疫組化方法檢測(cè)各組缺血心肌PAR表達(dá)。心肌標(biāo)本用4%多聚甲醛固定,連續(xù)切片4μm厚,滴加1:100稀釋小鼠PAR單克隆抗體,4℃孵育過(guò)夜,加生物素標(biāo)記的馬抗小鼠二抗,37℃孵育20min,加親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(avidin-biotin-peroxidasecomplex,A

15、BC)-辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase.HRP)37℃孵育后,二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidineDAB)顯色,蘇木素復(fù)染。
　　 結(jié)果：
　　 1、大鼠心肌缺血45分鐘再灌注不同時(shí)點(diǎn)導(dǎo)致心肌不同程度的損傷。
　　 2、大鼠心肌缺血45分鐘后,不同時(shí)點(diǎn)(0min、15min、2h、6h、24h)的再灌注心肌以及外周血白細(xì)胞內(nèi)存在不同程度PARP-1活化產(chǎn)物PAR的表

16、達(dá)。缺血45分鐘再灌注0min,心肌PARP-1無(wú)明顯活化,而再灌注后15min心肌PARP-1活性即刻顯著增高,再灌注2h-6h達(dá)峰值,并持續(xù)活化至再灌注24h。PAR染色主要位于缺血心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及浸潤(rùn)的單核細(xì)胞核內(nèi)。同時(shí)點(diǎn)檢測(cè)出外周血白細(xì)胞內(nèi)PARP-1活化變化同心肌改變相似。
　　 3、再灌注早期不同時(shí)點(diǎn)外周血白細(xì)胞和心肌PARP-1活化產(chǎn)物PAR的表達(dá)具有相關(guān)性(r2=0.692,P＜0.001)。
　

17、　 4、再灌注6h外周血白細(xì)胞PARP.1活化產(chǎn)物PAR的表達(dá)與心肌梗死大小具有相關(guān)性(r2=0.836,P＜0.001),而再灌注2h(r2=0.341,P=0.076)和24h(r2=0.119,P=0.33)未發(fā)現(xiàn)二者存在相關(guān)性。
　　 5、PARP抑制劑3-AB顯著減少大鼠再灌注2h心肌梗死范圍(57.6±2.7%vs.40.9±2.3%,P＜0.001)。
　　 6、PARP抑制劑3-AB有效抑制再灌注2h大

18、鼠外周血白細(xì)胞及心肌PARP活化。假手術(shù)組大鼠心肌中只有微弱的PAR表達(dá)。I/R組大鼠外周血白細(xì)胞及心肌中的PAR表達(dá)明顯增加(P＜0.001),應(yīng)用3-AB后,PAR表達(dá)降低,與I/R組相比P＜0.05。
　　 7、PARP-1抑制劑3-AB有效治療時(shí)間窗:再灌注前15分鐘(49.3±1.7%vs.67.3±1.8%,P＜0.001)和延遲給藥再灌注后15分鐘(52.2±2.1%vs.66.5±2.6%,P=0.001)、2小

19、時(shí)(56.6±1.7%vs.67.1±2.2%,P＜0.05)均具有保護(hù)作用,而延遲給藥至再灌注后4小時(shí)未能減小梗死范圍(59.1±2.3%vs.66.2±2.7%.)。
　　 結(jié)論：
　　 再灌注早期循環(huán)白細(xì)胞PAR表達(dá)與心肌PAR表達(dá)存在正相關(guān),再灌注6h外周血白細(xì)胞PARP-1活化產(chǎn)物PAR的表達(dá)與心肌梗死大小具有相關(guān)性,循環(huán)白細(xì)胞的PARP-1活化可能作為臨床監(jiān)測(cè)再灌注損傷的特異性標(biāo)志物。PARP-1抑制劑3-A