人參皂甙Rd通過(guò)影響多聚ADP-核糖保護(hù)腦缺血損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前腦卒中已經(jīng)成為威脅人類(lèi)生存和健康的第二大致死原因，其摧毀性和復(fù)雜性都是其它疾病難以比擬的。但是，用來(lái)治療腦卒中的臨床藥物效果都不甚理想，因此，發(fā)掘新型治療藥物迫在眉睫。
　　2000年來(lái)人參一直被遠(yuǎn)東國(guó)家視為典型的補(bǔ)藥，而今這種稀有珍貴的中草藥已被全世界所廣泛熟知。人參皂甙（Ginsenoside，GS）是從五加科植物人參的根莖葉中提取精制而成，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)40余種人參單體皂甙成分。大量研究表明人參皂甙在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)

2、和神經(jīng)保護(hù)作用，可以抵抗動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶、延緩衰老等。由于人參有很多藥用價(jià)值，目前人參皂甙單體的研究已經(jīng)成為一大熱點(diǎn)。人參皂甙Rd（GSRd）是其中具有廣泛活性的生物單體之一。我們前期的臨床和基礎(chǔ)研究都表明GSRd對(duì)腦缺血后神經(jīng)損傷有重要的保護(hù)作用。由我科牽頭的多中心、雙盲、對(duì)照、安慰劑的Ⅱ、Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)“人參皂苷Rd注射液治療急性腦梗死的研究”已經(jīng)證實(shí)GSRd對(duì)急性腦梗死有顯著療效，并且具有較高的安全性。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)

3、現(xiàn) GSRd可抑制鈣離子內(nèi)流，從而抵抗谷氨酸興奮性毒性損傷；緩解大鼠腦缺血后早期氧化損傷和炎癥損傷；緩解大鼠局灶性腦缺血后線(xiàn)粒體功能失調(diào)和細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果均提示，GSRd具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，可能成為治療缺血性腦卒中的一種新型候選藥。然而，GSRd是如何發(fā)揮作用的目前尚不清楚，闡明其機(jī)制對(duì)GSRd全面臨床應(yīng)用具有重要意義。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，GSRd可減少大鼠腦缺血后細(xì)胞核內(nèi)凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的含量，而多聚ADP核糖[Poly(

4、ADP-ribose)，PAR]是促進(jìn)AIF從線(xiàn)粒體向胞核轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的重要分子。
　　PAR是由多聚ADP核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]家族催化合成，后者是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一種含量較豐富的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)有17個(gè)成員，其中PARP-1含量最高、作用最廣泛。PARP-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有PAR修飾活性的蛋白，能夠以NAD+為底物合成直線(xiàn)狀和分枝狀的PAR，對(duì)自身和一些核

5、相關(guān)蛋白進(jìn)行核糖化修飾，形成PAR聚合物。隨后由PARP甘油水解酶PARG將ADP核糖從蛋白上降解，維持PAR在體內(nèi)正常水平和循環(huán)。該P(yáng)AR核糖基化反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，該修飾作用于許多蛋白，涉及到染色體的穩(wěn)定，DNA損傷修復(fù)，基因轉(zhuǎn)錄等方面。正常細(xì)胞內(nèi)，組成性的PAR聚合物含量很低，被修飾蛋白上帶有很少的ADP核糖基團(tuán)；而在DNA損傷如腦缺血后，PARP-1大量激活，細(xì)胞內(nèi)的PAR聚合物生成的速度明顯增快。PARP-1的激活包

6、含兩方面的意義：（1）PARP-1激活后生成的PAR可作用于核相關(guān)受體蛋白，如DNA修復(fù)蛋白，組蛋白等，促進(jìn)DNA的修復(fù)；（2）PAR向線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)移，可促使線(xiàn)粒體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致DNA損傷加重，細(xì)胞死亡；PARP-1激活后使NF-κB核聚集并促進(jìn)NF-κB相關(guān)性的基因表達(dá)，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)過(guò)程。因此，損傷輕微情況下，PARP-1輕度激活，促進(jìn)損傷細(xì)胞修復(fù)；但當(dāng)PARP-1過(guò)度激活時(shí)，下游NF-κB急劇增加引發(fā)炎癥

7、造成細(xì)胞壞死，AIF從線(xiàn)粒體向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致凋亡，從而造成細(xì)胞死亡。
　　近期實(shí)驗(yàn)證明，GSRd可減少大鼠腦缺血后細(xì)胞核內(nèi)AIF水平，提示GSRd可能通過(guò)影響AIF相關(guān)的PARP-1通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)擬采用大鼠局灶性大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注（middle cerebral artery occlusion, MCAO）損傷模型，研究GSRd和PAR聚合物的關(guān)系，初步探討GSRd的急性腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。
　　實(shí)

8、驗(yàn)一GSRd對(duì)大鼠MCAO損傷超急性期內(nèi)PAR聚合物的影響
　　目的：觀察GSRd缺血前預(yù)給藥對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷超急性期細(xì)胞核 PAR聚合物含量的影響（2h）。方法：60只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重280-300g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組，n=20）、丙二醇處理組（Vehicle組，n=20）和GSRd處理組（Rd組，n=20）。Vehicle組和Rd組大鼠采用MCAO線(xiàn)栓法阻塞大鼠右

9、側(cè)大腦中動(dòng)脈，2h后拔出栓線(xiàn)達(dá)到再灌注目的，建立急性局灶性腦缺血再灌注模型。Vehicle組和Rd組分別于造模前30分鐘腹腔注射丙二醇（GSRd稀釋液，10mg/Kg）和GSRd（10mg/Kg）。Sham組手術(shù)操作同前，但線(xiàn)栓未阻塞大腦中動(dòng)脈。Western blotting印跡和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞2h PAR聚合物的表達(dá)量。結(jié)果：與Sham組相比，Vehicle組和Rd組缺血側(cè)腦組織PAR聚合物含量增加(P<0.

10、01)；與Vehicle組相比，Rd組缺血側(cè)腦組織PAR聚合物含量明顯上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論：10 mg/Kg GSRd預(yù)處理可明顯增加MCAO損傷超急性期內(nèi)PAR聚合物的含量。
　　實(shí)驗(yàn)二GSRd對(duì)大鼠MCAO損傷急性期PAR聚合物和NF-κB的影響
　　目的：觀察GSRd缺血前預(yù)給藥對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷急性期細(xì)胞核PAR聚合物、NF-κB含量的影響（12h-24h）。方法：采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，分別在

11、缺血后12h、18h、24h觀察細(xì)胞核內(nèi)PAR聚合物、NF-κB的含量。SD大鼠隨機(jī)分為正常組、單純 Rd組、MCAO組、MCAO+Rd組。用Western blotting方法分別于大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞12h、18h、24h檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)PAR聚合物、NF-κB的含量。結(jié)果：Western blotting結(jié)果顯示，腦缺血再灌注損傷急性期（12h-24h），細(xì)胞核內(nèi)PAR聚合物以及NF-κB表達(dá)量顯著增高；使用10mg/Kg GSRd預(yù)處

12、理后，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞核內(nèi)PAR聚合物的含量顯著減少，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB含量降低。結(jié)論：GSRd可以減少腦缺血急性期細(xì)胞核內(nèi) PAR聚合物含量，減少細(xì)胞核內(nèi)活化的NF-κB數(shù)量，抵制腦缺血再灌注損傷后的炎性應(yīng)激反應(yīng)。提示 GSRd可能通過(guò)與PARP-1相關(guān)途徑發(fā)揮腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三GSRd對(duì)PARP活性直接作用的研究
　　目的：驗(yàn)證GSRd是否可以直接作用PARP并抑制其活性從而發(fā)揮腦缺血后的神經(jīng)保護(hù)作用。方

13、法：本實(shí)驗(yàn)選用HT Universal Chemiluminescent PARP AssayΚit with Histone-coatd Strip Wells試劑盒，主要用于篩選PARP的可能抑制劑及抑制劑的IC50，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。具體分組如下：1）單純PARP組；2）PARP+1μM Rd組；3）PARP+10μM Rd組；4）PARP+100μM Rd組；5）PARP+100μM3-AB組。結(jié)果：100μM3-AB陽(yáng)性對(duì)照