人參皂甙Rd通過影響多聚ADP-核糖保護腦缺血損傷的實驗研究.pdf

1、目前腦卒中已經成為威脅人類生存和健康的第二大致死原因，其摧毀性和復雜性都是其它疾病難以比擬的。但是，用來治療腦卒中的臨床藥物效果都不甚理想，因此，發(fā)掘新型治療藥物迫在眉睫。
　　2000年來人參一直被遠東國家視為典型的補藥，而今這種稀有珍貴的中草藥已被全世界所廣泛熟知。人參皂甙（Ginsenoside，GS）是從五加科植物人參的根莖葉中提取精制而成，現已發(fā)現40余種人參單體皂甙成分。大量研究表明人參皂甙在中樞神經系統(tǒng)中具有神經營養(yǎng)

2、和神經保護作用，可以抵抗動脈粥樣硬化、增強學習記憶、延緩衰老等。由于人參有很多藥用價值，目前人參皂甙單體的研究已經成為一大熱點。人參皂甙Rd（GSRd）是其中具有廣泛活性的生物單體之一。我們前期的臨床和基礎研究都表明GSRd對腦缺血后神經損傷有重要的保護作用。由我科牽頭的多中心、雙盲、對照、安慰劑的Ⅱ、Ⅲ期臨床實驗“人參皂苷Rd注射液治療急性腦梗死的研究”已經證實GSRd對急性腦梗死有顯著療效，并且具有較高的安全性。在動物實驗中，我們發(fā)

3、現 GSRd可抑制鈣離子內流，從而抵抗谷氨酸興奮性毒性損傷；緩解大鼠腦缺血后早期氧化損傷和炎癥損傷；緩解大鼠局灶性腦缺血后線粒體功能失調和細胞凋亡。上述結果均提示，GSRd具有明顯的神經保護作用，可能成為治療缺血性腦卒中的一種新型候選藥。然而，GSRd是如何發(fā)揮作用的目前尚不清楚，闡明其機制對GSRd全面臨床應用具有重要意義。我們近期的研究發(fā)現，GSRd可減少大鼠腦缺血后細胞核內凋亡誘導因子（AIF）的含量，而多聚ADP核糖[Poly(

4、ADP-ribose)，PAR]是促進AIF從線粒體向胞核轉移，并誘導細胞死亡的重要分子。
　　PAR是由多聚ADP核糖聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]家族催化合成，后者是哺乳動物細胞中一種含量較豐富的核基質結合蛋白，目前已發(fā)現有17個成員，其中PARP-1含量最高、作用最廣泛。PARP-1是第一個被發(fā)現具有PAR修飾活性的蛋白，能夠以NAD+為底物合成直線狀和分枝狀的PAR，對自身和一些核

5、相關蛋白進行核糖化修飾，形成PAR聚合物。隨后由PARP甘油水解酶PARG將ADP核糖從蛋白上降解，維持PAR在體內正常水平和循環(huán)。該PAR核糖基化反應是細胞內進行的翻譯后修飾，該修飾作用于許多蛋白，涉及到染色體的穩(wěn)定，DNA損傷修復，基因轉錄等方面。正常細胞內，組成性的PAR聚合物含量很低，被修飾蛋白上帶有很少的ADP核糖基團；而在DNA損傷如腦缺血后，PARP-1大量激活，細胞內的PAR聚合物生成的速度明顯增快。PARP-1的激活包

6、含兩方面的意義：（1）PARP-1激活后生成的PAR可作用于核相關受體蛋白，如DNA修復蛋白，組蛋白等，促進DNA的修復；（2）PAR向線粒體轉移，可促使線粒體內凋亡誘導因子（AIF）向胞核內轉移，導致DNA損傷加重，細胞死亡；PARP-1激活后使NF-κB核聚集并促進NF-κB相關性的基因表達，進而參與炎性反應過程。因此，損傷輕微情況下，PARP-1輕度激活，促進損傷細胞修復；但當PARP-1過度激活時，下游NF-κB急劇增加引發(fā)炎癥

7、造成細胞壞死，AIF從線粒體向胞核內轉移導致凋亡，從而造成細胞死亡。
　　近期實驗證明，GSRd可減少大鼠腦缺血后細胞核內AIF水平，提示GSRd可能通過影響AIF相關的PARP-1通路發(fā)揮神經保護作用。本實驗擬采用大鼠局灶性大腦中動脈缺血/再灌注（middle cerebral artery occlusion, MCAO）損傷模型，研究GSRd和PAR聚合物的關系，初步探討GSRd的急性腦缺血后神經保護作用機制。
　　實

8、驗一GSRd對大鼠MCAO損傷超急性期內PAR聚合物的影響
　　目的：觀察GSRd缺血前預給藥對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷超急性期細胞核 PAR聚合物含量的影響（2h）。方法：60只健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重280-300g，隨機分為假手術組（Sham組，n=20）、丙二醇處理組（Vehicle組，n=20）和GSRd處理組（Rd組，n=20）。Vehicle組和Rd組大鼠采用MCAO線栓法阻塞大鼠右

9、側大腦中動脈，2h后拔出栓線達到再灌注目的，建立急性局灶性腦缺血再灌注模型。Vehicle組和Rd組分別于造模前30分鐘腹腔注射丙二醇（GSRd稀釋液，10mg/Kg）和GSRd（10mg/Kg）。Sham組手術操作同前，但線栓未阻塞大腦中動脈。Western blotting印跡和免疫組織化學方法檢測大鼠大腦中動脈阻塞2h PAR聚合物的表達量。結果：與Sham組相比，Vehicle組和Rd組缺血側腦組織PAR聚合物含量增加(P<0.

10、01)；與Vehicle組相比，Rd組缺血側腦組織PAR聚合物含量明顯上調(P<0.01)。結論：10 mg/Kg GSRd預處理可明顯增加MCAO損傷超急性期內PAR聚合物的含量。
　　實驗二GSRd對大鼠MCAO損傷急性期PAR聚合物和NF-κB的影響
　　目的：觀察GSRd缺血前預給藥對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷急性期細胞核PAR聚合物、NF-κB含量的影響（12h-24h）。方法：采用大鼠大腦中動脈阻塞模型，分別在

11、缺血后12h、18h、24h觀察細胞核內PAR聚合物、NF-κB的含量。SD大鼠隨機分為正常組、單純 Rd組、MCAO組、MCAO+Rd組。用Western blotting方法分別于大鼠大腦中動脈阻塞12h、18h、24h檢測細胞核內PAR聚合物、NF-κB的含量。結果：Western blotting結果顯示，腦缺血再灌注損傷急性期（12h-24h），細胞核內PAR聚合物以及NF-κB表達量顯著增高；使用10mg/Kg GSRd預處

12、理后，相應時間點細胞核內PAR聚合物的含量顯著減少，細胞核內NF-κB含量降低。結論：GSRd可以減少腦缺血急性期細胞核內 PAR聚合物含量，減少細胞核內活化的NF-κB數量，抵制腦缺血再灌注損傷后的炎性應激反應。提示 GSRd可能通過與PARP-1相關途徑發(fā)揮腦缺血后的神經保護作用。
　　實驗三GSRd對PARP活性直接作用的研究
　　目的：驗證GSRd是否可以直接作用PARP并抑制其活性從而發(fā)揮腦缺血后的神經保護作用。方

13、法：本實驗選用HT Universal Chemiluminescent PARP AssayΚit with Histone-coatd Strip Wells試劑盒，主要用于篩選PARP的可能抑制劑及抑制劑的IC50，按照說明書進行操作。具體分組如下：1）單純PARP組；2）PARP+1μM Rd組；3）PARP+10μM Rd組；4）PARP+100μM Rd組；5）PARP+100μM3-AB組。結果：100μM3-AB陽性對照