APP與NCAM異構(gòu)體選擇性相互作用的初步研究.pdf

1、阿爾茨海默病(AD)為最常見的癡呆，約占各種癡呆病例的50％至80％。在老齡化急速發(fā)展的當(dāng)前，AD已經(jīng)成為我國不容回避的社會公共健康問題之一。AD主要病理特征是腦部神經(jīng)斑塊與神經(jīng)纖維纏結(jié)的密度及分布的病理變化，而目前對參與神經(jīng)斑塊形成的前體蛋白APP的正常功能了解甚少。我們利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)在小鼠腦組織及體外培養(yǎng)的CHO與COS-7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了APP與NCAM的相互作用，并且這種作用具有選擇性，即APP僅與NCAM-140結(jié)合而不與具有相

2、同胞外段的另一異構(gòu)體NCAM-180結(jié)合。通過構(gòu)建APP與NCAM-140的多種突變體并進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了兩種蛋白作用位點(diǎn)為胞外段，具體為APP胞外保守的CAPPD結(jié)構(gòu)域。
　　 在確認(rèn)APP與NCAM相互作用的基礎(chǔ)上，我們對這種選擇性相互作用的功能進(jìn)行了初步研究。根據(jù)被廣泛接受的淀粉樣斑塊級聯(lián)假說，APP水解切割產(chǎn)物Aβ的聚集為AD早期主要的病因，因此我們首先利用ELISA實(shí)驗(yàn)研究了NCAM-140對APP水解

3、切割產(chǎn)物Aβ影響，向穩(wěn)轉(zhuǎn)APP的單克隆細(xì)胞株CHO/APP中轉(zhuǎn)染不同劑量的NCAM-140，收集培養(yǎng)上清中的Aβ40與Aβ42并測定其含量。結(jié)果顯示NCAM-140可以影響Aβ的生成。
　　 其次，ERK信號通路參與了APP的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與水解代謝，在AD中此信號通路的信號分子發(fā)生了改變，我們利用共轉(zhuǎn)染的方法重點(diǎn)研究了APP與NCAM-140的選擇性相互作用對ERK信號通路的兩種信號分子ERK1與ERK2的激活調(diào)控;COS-7細(xì)胞中

4、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APP與NCAM-140的相互作用可以協(xié)同提高ERKs磷酸化水平，這種協(xié)同作用需要兩者的相互作用，特別是NCAM-140的胞內(nèi)段發(fā)揮了重要的作用。
　　 最后，為得到含有SBP與CBP純化標(biāo)簽的分泌型APP(sAPPα)融合蛋白，我們構(gòu)建了分泌型APP的重組質(zhì)粒;并轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞經(jīng)G418篩選獲得了單克隆細(xì)胞株。純化分泌型APP蛋白并包被細(xì)胞培養(yǎng)板，把瞬轉(zhuǎn)NCAM-140的細(xì)胞平鋪在此板上，從而構(gòu)建了APP與NCA