殼聚糖衍生物納米顆粒在乙肝疫苗中的應(yīng)用研究.pdf

1、我們新合成了多種殼聚糖的陽離子衍生物，并用其作為載體包裹重組非顆粒形式的乙肝HBcAg蛋白作為候選疫苗。為了評價其作為疫苗的可行性，以及誘導(dǎo)通過“內(nèi)吞體至胞漿”途徑形成交叉遞呈的潛力，我們利用一系列試驗對候選疫苗進(jìn)行篩選，這些方法包括透射電鏡、體外包裹及釋放試驗以及兩個可以反映對內(nèi)吞體的破壞能力的試驗：體外的溶血試驗和與RAW264.7共孵育后進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察。我們利用選取的殼聚糖衍生物(它們包括N-trimethylaminoet

2、hylmethacrylatechloride-Methylmethacrylate(TM)，Chitosan-Methylmethacrylate(CM)，Chitosan-N-trimethylaminoethylmethacrylatechloride-Methylmethacrylate(CTM)andChitosan-N-dimethylaminoethylmethacrylatehydrochloride-Methylmet

3、hacrylate(CDM))包裹重組的乙肝HBcAg蛋白對小鼠進(jìn)行免疫并且評價其免疫效果。與被接種純蛋白溶液的組相比，這些接受候選疫苗免疫的小鼠被誘導(dǎo)出很強(qiáng)的特異性體液以及細(xì)胞免疫。在這些候選疫苗之中，CTM包裹的蛋白疫苗的免疫原性是最強(qiáng)的。從體內(nèi)的免疫接種效果以及體外的一系列試驗來看，通過納米粒的包裹，候選疫苗可以通過“內(nèi)吞體到胞漿”的途徑來引起交叉遞呈，同時也說明了此疫苗投放系統(tǒng)是大有潛力的。 誘導(dǎo)針對乙肝病毒抗原有效的細(xì)

4、胞以及體液免疫的疫苗策略，是治療慢性乙肝的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的核酸疫苗具有能有誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，然而它的效率不是很理想。為了提高相應(yīng)核酸疫苗的效果，我們也研究了幾種新合成的殼聚糖的陽離子衍生物作為納米顆粒疫苗佐劑的應(yīng)用情況。這些殼聚糖衍生物納米粒在生理條件下顯示更好的可溶性，增加了吸附親水性分子的能力。這些納米顆粒在體外可以保護(hù)DNA分子，延緩脫氧核糖核酸酶I的分解作用。溶血試驗和激光共聚焦顯示這些納米具有膜破壞活性因此具有潛在的加

5、強(qiáng)基因轉(zhuǎn)染的能力。我們用這些納米粒去包裹pVAX-HBc的DNA疫苗，然后免疫C57BL/6小鼠，隔一周注射，共接種兩次。不同時間點(diǎn)的細(xì)胞和體液免疫指標(biāo)用ELISA反應(yīng)，ELISPOTandCTL特異細(xì)胞毒試驗來進(jìn)行評價。試驗結(jié)果表明，我們的納米粒劑型可以有效地在多方面增強(qiáng)pVAX-HBc核酸疫苗的免疫原性：增加抗體的產(chǎn)生，提高γ干擾素的分泌水平以及提高免疫小鼠的特異性CTL活性。這些結(jié)果都證明了殼聚糖衍生物作為pVAX-HBc核酸疫苗