乙肝疫苗評價技術及其應用研究.pdf

1、通常MHC Ⅰ類四聚體被用于定量分析表位特異的CDS<'+>T細胞。MHC Ⅰ類四聚體是由4個MHC Ⅰ類復合物和一個帶有熒光標的親和素分子構成的。其中每個MHC Ⅰ類復合物是由分別表達、純化的MHC分子的重鏈和β 2微球蛋白與表位肽在折疊緩沖液中共折疊所形成的。這種方法勢必會形成較多的多聚物和自身折疊產(chǎn)物，而且同時純化兩種單體是很費時的。為了解決這些問題，在本研究中，我們將串聯(lián)設計的人/鼠嵌合MHC分子的重鏈(HLA-A2 α1，HL

2、A-A2 α2，MHC-H2D α3)與β2微球蛋白克隆到pET17b載體上，并表達為融合蛋白。將融合蛋白與HLA-A2限制性表位肽兩者共折疊形成人/鼠嵌合MHC Ⅰ類復合物。這樣就會提高四聚體的得率，同時也可以節(jié)省大量時間。此外，我們還采用了凝膠遲滯的方法來檢測人/鼠嵌合MHC Ⅰ類復合物生物素化的效率。我們將最終形成的人/鼠嵌合四聚體用于體外定量檢測HLA-A2轉基因鼠上所產(chǎn)生的HLA-A2限制性細胞免疫水平。 由于缺少合適

3、的動物模型，在體內對人乙肝疫苗免疫原性的臨床前評價一直受到了制約。在本研究中，我們構建了同時表達HBV和HLA兩種基因的HBV/HLA-A2.1雙轉基因鼠。此雙轉基因鼠不僅表現(xiàn)出對HBV各種抗原的耐受，而且能夠有效地遞呈HLA-A2限制性抗原表位。我們用HLA-A2限制性HBc或HBs的表位疫苗免疫此雙轉基因鼠，借助CTL實驗、酶聯(lián)免疫斑點實驗和四聚體染色等手段證明此雙轉基因鼠能夠被有效的誘導出針對HLA-A2限制性HBe和HBs特異性

4、的免疫應答。 總之，我們構建的有生物活性的人/鼠嵌合四聚體以及HBV/HLA-A2.1雙轉基因鼠國內外均未見報道。人.鼠嵌合四聚體能恰當?shù)亩糠从矵LA-A2限制性細胞免疫水平。同時，HBV/HLA-A2.1雙轉基因小鼠能夠從多方面評價人乙肝疫苗的免疫原性：抗體的產(chǎn)生、γ干擾素的分泌水平、免疫小鼠的特異性CTL活性和有效降低體內抗原水平。這些結果也進一步證明了HBV/HLA-A2.1雙轉基因小鼠作為評價人乙肝病毒疫苗免疫原性動物