金槍魚(yú)降血壓肽的基因設(shè)計(jì)、克隆表達(dá)和活性評(píng)價(jià).pdf

1、高血壓病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，已高居死亡原因的首位。食源性降血壓肽通過(guò)抑制血壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)關(guān)鍵性酶一血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)，而起到降血壓的作用，具有作用溫和、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，成為目前研究熱點(diǎn)。從天然蛋白酶解（水解）產(chǎn)物中分離提取降血壓肽的方法工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低，而基因工程法可以克服這些缺點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。本文研究的目標(biāo)是通過(guò)生物信息學(xué)和基因工程手段，采用工程菌發(fā)酵技術(shù)，大批量制備具有高活性和穩(wěn)定性的金槍魚(yú)降血壓肽Tuna AI(PT

2、HIKWGD)。主要內(nèi)容為:開(kāi)發(fā)基于生物信息學(xué)平臺(tái)的小肽串聯(lián)基因設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)軟件，用于降血壓肽基因的設(shè)計(jì)并分析其宿主菌環(huán)境，研究低成本重組蛋白和多肽的純化方法，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行安全評(píng)估和活性檢測(cè)，并建立降血壓肽快速檢測(cè)方法。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)開(kāi)發(fā)了用于小肽串聯(lián)表達(dá)設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)軟件《肽表達(dá)大師PeptideExpression Master》。以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，利用該軟件對(duì)Tuna AI進(jìn)行串聯(lián)基因單元設(shè)計(jì)

3、，選擇甲酸作為后續(xù)重組多肽串聯(lián)體釋放多肽單體的水解體系。根據(jù)設(shè)計(jì)方案，構(gòu)建了Tuna AI4拷貝基因單元，以此基因出發(fā)構(gòu)建了克隆載體pUC-4nTunaAI、表達(dá)載體pET-4nTunaAI和工程菌BL21-pET-4nTunaAI（n=1、2、4和8）。工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后，所有拷貝數(shù)的基因都能成功表達(dá)，表達(dá)量隨拷貝數(shù)的提高而提高，工程菌BL21-pET-32TunaAI的串聯(lián)基因表達(dá)量最高，其重組蛋白Fusion-32TunaAI的量約為

4、細(xì)胞總蛋白的45.2％。
　　(2)研究了適合重組蛋白Fusion-32TunaAI純化的超聲輔助尿素清洗方法。與表達(dá)載體提供Ni2+親和層析方法相比，此方法具有更好的純化效果（回收率提高了32.6％）。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)33℃、6h誘導(dǎo)條件下制備的重組蛋白包涵體的量只有37℃條件下（460.8 mg/L培養(yǎng)基）的58.2％，所以選擇37℃、6h作為誘導(dǎo)條件，以超聲輔助尿素清洗法制備的包涵體量為指標(biāo)，進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)。

5、r>　　(3)研究了工程菌在5種常見(jiàn)的培養(yǎng)基中重組蛋白包涵體的表達(dá)情況，綜合考慮，選擇LB培養(yǎng)基作為后續(xù)試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基。在LB中分別添加10 mMCa2+、Mg2+、K+和EDTA，只有Mg2+可以促進(jìn)包涵體的表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌，添加重組蛋白中8種高含量氨基酸（P、T、H、I、K、W、G和D）后，細(xì)胞密度均上升，但其中只有添加高稀缺系數(shù)的氨基酸（H和Y），包涵體的量才有極顯著提升。對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌施加超聲處理，頻

6、率為24±2 kHz的掃頻超聲處理1.5 min對(duì)促進(jìn)包涵體形成效果最好。最終優(yōu)化的培養(yǎng)基為含10mM Mg2+的LB，誘導(dǎo)條件為加入IPTG誘導(dǎo)的同時(shí)，加入10mM的色氨酸(Y)，并進(jìn)行低強(qiáng)度掃頻超聲處理(功率強(qiáng)度0.095 W/cm3，頻率為24±2 kHz，時(shí)間為1.5 min)，繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)6h，包涵體的量可達(dá)766.51±44.24 mg/L培養(yǎng)基。
　　(4)研究了重組多肽的低成本純化方法以及多肽活性和安全性

7、。單體重組多肽通過(guò)甲酸切割從重組蛋白Fusion-32TunaAI釋放后，依次經(jīng)透析、離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用和氨基酸測(cè)序確認(rèn)為T(mén)una AI，最終產(chǎn)量為351.7 mg Tuna AI/L發(fā)酵液（純度為97％）。研究表明制備的重組多肽Tuna AI具有良好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性。為檢測(cè)多肽內(nèi)毒素指標(biāo)，以TunaAI的最大濃度（0.4 g/kg體重）灌胃小鼠ICR，12h內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)因內(nèi)毒素的攝入而引起炎癥反應(yīng)。以

8、此劑量連續(xù)灌胃小鼠3次，觀(guān)察7天，結(jié)果表明Tuna AI沒(méi)有明顯急性毒副作用，有較好的安全性(LD50＞1.2 g/kg)。
　　(5)研究了Tuna AI體內(nèi)降血壓試驗(yàn)及其機(jī)理。一次性灌胃后，不同劑量Tuna AI能顯著地降低大鼠SHR的血壓值，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，而Tuna AI對(duì)正常大鼠WKyR的血壓沒(méi)有顯著性影響。高劑量Tuna AI（2.0 mg/kg體重）灌胃SHR后，降血壓效果可以維持10h，其中灌胃6h后達(dá)到最大血壓降

9、幅（36.5 mmHg），灌胃8和10h后的降血壓效果強(qiáng)于captopril對(duì)照。測(cè)定一次性灌胃6h后各組織ACE活性，發(fā)現(xiàn)Tuna AI主要抑制了動(dòng)脈的ACE活性（抑制率為44.1％），對(duì)心、肺和血清的ACE酶活沒(méi)有明顯抑制作用，同時(shí)測(cè)得心臟的SERCA2a基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量提升了1.2倍，動(dòng)脈內(nèi)皮素的轉(zhuǎn)錄mRNA量減少了31.6％，說(shuō)明給藥后，Tuna AI抑制了ACE的活性，使得AngⅡ的含量降低，進(jìn)一步調(diào)控與血壓調(diào)控有關(guān)的SE

10、RCA2a基因和內(nèi)皮素基因的表達(dá)，使得血壓下降。連續(xù)35天灌胃后，大鼠SHR的血壓都有明顯下降，在給藥第2周血壓值就達(dá)到平穩(wěn)的水平，降壓最大幅度為41.6 mmHg，同樣的Tuna AI對(duì)WKyR的血壓沒(méi)有顯著性影響。連續(xù)灌胃對(duì)SHR和WKyR的體重增加量、全血指標(biāo)和血清中膽固醇、葡萄糖、甘油三酯也沒(méi)有明顯的影響，但大鼠SHR的心肌酶(肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶同工酶(LDH1))分別下降了24.8％和43.0％。說(shuō)明連續(xù)

11、給藥TunaAI控制血壓后，可一定程度減少因高血壓對(duì)大鼠心血管造成的損傷。
　　(6)研究建立了一種Tuna AI的ELISA快速檢測(cè)方法。將半抗原Tuna AI偶聯(lián)至牛血清白蛋白上，作為免疫原制備了抗血清。抗血清經(jīng)兩種親和柱純化，制備較高純度的多克隆抗體。利用該多克隆抗體，建立Tuna AI間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線(xiàn)，IC50為26.34 ng/mL，檢測(cè)限LOD為0.83 ng/mL，線(xiàn)性范圍為1.5～364.5ng/m