杏仁短肽制備及其降血壓活性研究.pdf

1、我國是杏和杏仁主產(chǎn)國之一.擁有豐富的杏仁資源。杏仁中蛋白質(zhì)含量高達25％以上,但杏仁蛋白的研究和產(chǎn)品開發(fā)相對落后。以蛋白為原料開發(fā)功能性短肽是目前功能食品研究領(lǐng)域的熱點,用特異的蛋白酶水解就有可能釋放出杏仁蛋白中的活性肽段。本文以冷榨脫脂杏仁粕為原料,利用酶解法制備高得率、高水解度杏仁短肽。并明確了其功能活性,旨在為杏仁蛋白的合理利用和高效增值提供指導(dǎo)和理論依據(jù)。
　　 探討了Alcalase、Protamex、Falvorzy

2、me、N120P、Neutrase和木瓜蛋白酶對杏仁粕的水解效果,選取中性蛋白酶Neutrase與N120P進行復(fù)合酶解,對酶解過程中酶用量、底物濃度、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素對水解效果的影響進行了系統(tǒng)地研究,通過正交旋轉(zhuǎn)組合試驗對復(fù)合水解的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化,建立了相關(guān)回歸模型；結(jié)合生產(chǎn)實際確定出了Neutrase與N120P酶解杏仁粕的參數(shù)最佳組合為:Neutrase:N120P=2:1(U／U);最適pH6.5;酶解溫度52

3、.5℃,加酶量7200 U／g,底物濃度4％,酶解時間173 min。在此條件作用下短肽得率為65.49±1.22％,水解度為26.20±0.35％.
　　 杏仁蛋白酶解產(chǎn)物分子量較低,其中小于1 kDa短肽占74.39％；采用超濾技術(shù)對杏仁短肽進行分離,研究了操作壓力、料液濃度和操作溫度對超濾過程的影響,確定了杏仁短肽一級超濾的最適條件:操作壓力20 psi、料液濃度4％、操作溫度35℃。二級超濾的最適條件:操作壓力25 ps

4、i、料液濃度6％、操作溫度40℃。經(jīng)過兩級超濾處理的杏仁短肽,分子量小于5 kDa的短肽得率為84.67％,分子量小于1 kDa的杏仁短肽得率為62.86％.
　　 利用體外化學(xué)模型對杏仁短肽的抗氧化活性和ACE抑制活性進行評價,證明杏仁短肽具有較強的抗氧化活性,其中小于1 kDa短肽抗氧化活性最強,清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基的IC50值分別為99.31 mg／mL,4.70 mg／mL,0.48 mg／mL

5、,且具有較高的還原力和亞油酸氧化抑制能力.杏仁短肽各分子量組分的ACE抑制活性非常突出,其中小于1 kDa短肽的ACE抑制活性最高,短肽粗品、大于5 kDa、1-5 kDa和小于1 kDa組分的IC50值為0.37 mg／mL,0.82 mg／mL,0.43 mg／mL和0.14 mg／mL。
　　 對分子量小于1 kDa杏仁短肽的ACE抑制機理進行了研究,Lineweaver-Burk模型證明杏仁短肽屬于非競爭性抑制劑,穩(wěn)定性

6、實驗表明小于1 kDa杏仁短肽具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性,對消化酶的水解具有一定的抗性,屬于真抑制型ACE抑制肽。動物實驗結(jié)果表明用100 mg／kg體重以上劑量的小于1 kDa杏仁短肽飼喂原發(fā)性高血壓大鼠(SHR),6 h內(nèi)可顯著降低大鼠的尾動脈收縮壓值,且杏仁短肽對SHR大鼠的心率均無影響;多次給藥動物實驗結(jié)果表明以400 mg／kg體重以上劑量的小于1 kDa杏仁短肽飼喂的SHR大鼠,28天后的尾動脈收縮壓顯著減低(p<0.0

7、5),且降壓作用平穩(wěn)。
　　 連續(xù)采用Scphadex G-15凝膠過濾、半制備RP-HPLC和RP-HPLC等分離分析方法,從小于1 kDa的杏仁短肽中分離出一種活性較強的ACE抑制肽f1。采用MALDI TOF-TOF／MS方法和2D-NMR對上述ACE抑制肽進行了結(jié)構(gòu)鑒定,其氨基酸序列為ILILLP,分子量679.6Da,ACE抑制IC50值為0.067 mg／mL(98.58μM).根據(jù)上述結(jié)果,采用固相合成方法人工合成

8、了一條氨基酸序列相同的短肽ILILLP,對其ACE抑制活性進行驗證,ACE抑制IC50值為0.077 mg／mL(114μM),活性較杏仁短肽ILILLP相比有所降低。
　　 對杏仁短肽制備工藝參數(shù)放大試驗,最終得到短肽產(chǎn)品總得率為58.40％,水解度為23.90％,純度大于50％,分子量小于10 kDa短肽占61.40％。放大實驗所得短肽粗品ACE抑制IC50值為0.46 mg／mL。放大試驗證明杏仁短肽制備工藝可以應(yīng)用到杏仁