長(zhǎng)蛇鯔魚(yú)肉蛋白制備分離降血壓肽研究.pdf

1、海洋生物蛋白是不同結(jié)構(gòu)功能物質(zhì)的理想、豐富的貯庫(kù)，尤其是一些海洋低值魚(yú)類(lèi)是制備生物活性肽理想的初始原料。以海洋低值魚(yú)類(lèi)為原料制備、分離降血壓肽正成為當(dāng)今一個(gè)研究熱點(diǎn)。長(zhǎng)蛇鯔(Saurida elongata)，長(zhǎng)蛇鯔屬，狗母魚(yú)科，主要分布于西北太平洋，為廣西北部灣經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)之一。本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)蛇鯔為原料，蛋白組成分析顯示長(zhǎng)蛇鯔是一種高蛋白原料，濕基粗蛋白15.34％，干基粗蛋白78.35％，含有18種氨基酸，氨基酸總含量達(dá)到791.41 mg

2、·g-1，其中8種人體必需氨基酸占總量的44.92％，非極性、疏水性氨基酸39.13％，極性氨基酸占總含量的60.87％。
　　 本研究選用六種蛋白酶水解長(zhǎng)蛇鯔魚(yú)肉蛋白，通過(guò)體外ACE抑制活性測(cè)定，篩選中性蛋白酶作為制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽(ACEI)的蛋白酶，其酶解產(chǎn)物對(duì)ACE抑制活性IC50為0.182 mg·mL-1。以水解度DH(Y1)和產(chǎn)物對(duì)ACE抑制率IP(Y2）雙指標(biāo)為參數(shù)，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法考察了酶解溫度、pH值

3、、酶/底(E/S)對(duì)水解度及抑制率的影響，優(yōu)化得到二元多次方程: Y1=23.77-0.81X1+3.21X2-1.65X3-0.84X1X2-0.35X1X3-0.95X2X3-1.76X12-0.99X22-0.33X32; Y2=83.32-2.27X1+2.94X2-2.02X3-0.33X1X2-1.76X1X3+1.64X2X3-3.35X12-3.39X22-2.30X32，并確定了最適酶解工藝條件為:E/S為10000

4、U·g-1、溫度為48℃、pH為7.0及水解時(shí)間120 min，在此工藝條件下水解度為24.07％，ACE抑制率為84.00％。利用超濾(UF)和凝膠層析(GFC)對(duì)酶解物進(jìn)行初步分離。酶解物經(jīng)超濾分離后活性組分得到富集，5kDa滲透液(LFPH-I)的IC50值為0.123 mg·mL-1。采用凝膠層析對(duì)LFPH-I進(jìn)一步分離，考察了各因素對(duì)凝膠層析的影響，得到最優(yōu)條件:柱規(guī)格(1.6 cm×45 cm)、蒸餾水洗脫1.0 mL·mi

5、n-1、上樣量為20 mg。在此條件下，可將LFPH-I分成A、B、C、D、E五個(gè)組分，其中C組分(LFPH-I-C)活性最高，IC50為0.110 mg·mL-1。考察了LFPH-I的抗胃腸道穩(wěn)定性能，實(shí)驗(yàn)表明LFPH-I經(jīng)胃蛋白酶消化后活性略有上升;經(jīng)胰蛋白酶作用穩(wěn)定性良好，但LFPH-I經(jīng)胃蛋白酶作用后再用胰蛋白酶處理則活性有所下降。采用離子交換色譜-反相高效液相色譜法結(jié)合（IEC/RP-HPLC法）分離純化LFPH-I-C，得到

6、活性組分G3;同時(shí)研究了連續(xù)多步反相高效液相色譜法(RP-HPLC/RP-HPLC/RP-HPLC法)分離純化LFPH-I-C，得到活性組分U73D。經(jīng)反相高效液相色譜和高效毛細(xì)管電泳檢測(cè)二者均為單一組分。通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定了G3和U73D結(jié)構(gòu)，解析其氨基酸序列分別為Arg-Val-Cys-Leu-Pro(RVCLP)和Ser-Pro-Arg-Cys-Arg(SPRCR)，IC50值分別為175μM和41μM。固定化金屬離子親和分離技

7、術(shù)（IMAC）在重組蛋白和重組多肽的分離純化中已得到廣泛應(yīng)用。在采用IEC/RP-HPLC法及RP-HPLC/RP-HPLC/RP-HPLC法分離純化LFPH-I-C得到長(zhǎng)蛇鯔降血壓肽結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，探索了IMAC分離長(zhǎng)蛇鯔降血壓肽的方法。以反相懸浮法制備瓊脂糖微球載體，確定了最佳制備工藝為瓊脂糖濃度2.5％，乳化劑用量1.5％，乳化溫度60℃，攪拌速度400 r·min-1，此時(shí)獲得的目標(biāo)微球載體成球率為70.80％。以環(huán)氧氯丙烷為活化劑

8、，確定了最佳活化條件為:NaOH溶液濃度為0.8mol·L-1，環(huán)氧氯丙烷體積分?jǐn)?shù)為20％，NaBH4的濃度為3.0 g·L-1，活化溫度為40℃，活化時(shí)間為4h。以活化的瓊脂糖微球?yàn)檩d體，亞氨基二乙酸(IDA)為連接臂，Cu2+、Ni2+、Zn2+為螯合金屬離子，分別制備了固定化AS-Cu2+、AS-Zn2+、AS-Ni2+三種親和介質(zhì)，其配基密度分別為32.05、33.22、29.17μmol·g-1?？疾烊N親和介質(zhì)在pH3.0-

9、9.0的范圍內(nèi)金屬離子的泄露百分率，結(jié)果表明酸性環(huán)境比堿性環(huán)境更容易讓金屬離子泄露，三種親和介質(zhì)中AS-Cu2+最穩(wěn)定性，AS-Ni2+次之，AS-Zn2+最容易泄露。分別研究了三種親和介質(zhì)AS-Cu2+、AS-Zn2+、AS-Ni2+對(duì)LFPH-I的吸附。以LFPH-I為原料，通過(guò)對(duì)比親和介質(zhì)分離ACEI的效果，篩選了AS-Ni2+作為長(zhǎng)蛇鯔ACEI分離的親和介質(zhì)。其最優(yōu)層析條件為:0.02 mol·L-1磷酸緩沖鹽(pH6.8，含1

10、.0 mol·L-1 NaCl)為平衡液、0.02 mol·L-1磷酸緩沖鹽(pH4.0，含0.5 mol·L-1 NaCl)為洗脫液。經(jīng)AS-Ni2+富集所得組分IC50值為0.116 mg·mL-1。通過(guò)測(cè)定、分析粗蛋白LFPH-I及親和層析富集組分的氨基酸摩爾百分比的變化，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)條件下，相對(duì)其它氨基酸，AS-Ni2+對(duì)Met、His、Tyr、Pro、Ile、Leu具有更高的富集作用。采用反相高效液相色譜對(duì)AS-Ni2+富集的組