腺苷1型受體在慢性心腎綜合征水鈉潴留中作用機(jī)制初探.pdf

1、背景:心腎綜合征(Cardiorenal Syndrome，CRS)是同時(shí)累及心臟和腎臟的一大組疾病的統(tǒng)稱，包括心臟（或腎臟）的急性或慢性功能不全導(dǎo)致腎臟（或心臟）的急性或慢性功能不全，或者共同因素同時(shí)導(dǎo)致心臟和腎臟的結(jié)構(gòu)和功能損害。心功能和腎功能之間有著緊密聯(lián)系，心腎同時(shí)受累，大大增加了疾病的診治難度和死亡率1,2。根據(jù)2010年ADKI(Acute Dialysis Quality Initiative)共識，心腎綜合征共分為5型3

2、。CRS的病理生理機(jī)制尚未完全闡明，各型CRS在病生理機(jī)制上存在共同特征，可分為血流動力學(xué)機(jī)制與非血流動力學(xué)機(jī)制4。其中血流動力學(xué)機(jī)制的核心是水鈉潴留和容量負(fù)荷增加，而非血流動力學(xué)機(jī)制包括腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Renin-Angiotensin-Aldosterone System，RAAS）和交感神經(jīng)系統(tǒng)激活、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等。
　　目前CRS動物模型多采用心腎手術(shù)構(gòu)建、以急性變化為主，沒有很好的模擬病理生理機(jī)制的慢

3、性CRS動物模型，限制了對其病生理機(jī)制的探究。高醛固酮高鹽飲食(DOCA-Salt)小鼠模型模擬了鹽敏感高血壓的病生理狀態(tài)，前期我們觀察到腎臟結(jié)構(gòu)和功能的損害。本研究試圖探索該模型是否同時(shí)存在心臟損害，從而為探究CRS機(jī)制提供平臺。
　　腺苷1型受體（Adenosine A1 Receptor, A1AR）通過調(diào)節(jié)腎臟管球反饋、促進(jìn)心臟釋放心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)調(diào)控水鹽負(fù)荷;在非

4、血流動力學(xué)機(jī)制方面，A1AR對RAAS起到直接抑制作用、對炎癥和凋亡起到調(diào)節(jié)作用。但目前沒有研究系統(tǒng)地探索在DOCA-Salt小鼠模型上A1AR對于心腎損害的意義。前期我們觀察到A1AR主要通過血流動力學(xué)因素保護(hù)DOCA-Salt小鼠腎臟結(jié)構(gòu)和功能，本研究試圖通過血流動力學(xué)機(jī)制和非血流動力學(xué)機(jī)制兩方面探索A1AR對DOCA-Salt小鼠心臟損害是否同樣具有保護(hù)作用。
　　目的:
　　1.觀察DOCA-Salt小鼠心臟損害，探

5、索DOCA-Salt模型作為慢性CRS模型的可能性;
　　2.探索A1AR在DOCA-Salt小鼠水鈉潴留中的作用;
　　3.探索A1AR在DOCA-Salt小鼠心肌肥大、心肌組織微血管密度、炎癥和纖維化中的作用。
　　方法及結(jié)果:
　　1.DOCA-Salt小鼠心臟損害在C57BL/6J野生型小鼠上，行左腎切除術(shù)，術(shù)中于左腎窩埋置醋酸脫氧皮質(zhì)酮(Deoxycorticosterone Acetate，DOCA)

6、緩釋藥片，術(shù)后予高鹽飲食，建立DOCA-Salt小鼠模型。采用尾套法測量血壓、心率，觀察到DOCA-Salt小鼠心率隨實(shí)驗(yàn)周數(shù)顯著下降（0周685.8±25.4 vs.8周526.6±103.9次/分，P＜0.01），平均動脈壓顯著上升（0周74.6±4.4 vs.8周88.5±6.5 mmHg，P＜0.01）。分別于第4周和第8周處死小鼠，并留取心臟標(biāo)本，稱量全心重量，觀察到第8周時(shí)心臟重量指數(shù)顯著增加（7.05±0.83 vs.5.

7、16±0.20mg/g，P=0.007）。常規(guī)HE染色觀察心肌組織鏡下改變并測量左心室厚度無顯著變化。Van Gieson膠原染色觀察心肌組織纖維化程度，發(fā)現(xiàn)從第4周起出現(xiàn)局灶性間質(zhì)纖維化;運(yùn)用Realtime PCR方法分析轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)、膠原纖維1(Collagen1)在實(shí)驗(yàn)組和對照組間無差異。CD34免疫組化染色觀察并分析心肌微血管密度，發(fā)現(xiàn)第4周時(shí)微

8、血管密度顯著增加（[1.01±0.003]％ vs.[0.59±0.001]％，P=0.030），第8周時(shí)微血管密度較對照組無顯著變化。CD68免疫組化染色觀察并分析巨噬細(xì)胞浸潤程度，發(fā)現(xiàn)DOCA-Salt小鼠巨噬細(xì)胞浸潤程度與對照組無差異;運(yùn)用Realtime PCR方法分析趨化因子2(Chemokine C-Cmotif ligand2，CCL2)mRNA表達(dá)水平也無差異。
　　2.DOCA-Salt小鼠水鹽負(fù)荷在第0、4、8

9、周用代謝籠留24h尿，觀察到DOCA-Salt小鼠24h尿量（0周1173±464 vs.4周3606±2359 vs.8周7635±3017μl，兩兩比較P＜0.05）及24h尿鈉排出量（0周133.3±39.5 vs.4周798.4±719.4 vs.8周1788±854.0μmol/d，兩兩比較P＜0.05）隨實(shí)驗(yàn)周數(shù)顯著增加，尿滲透壓（0周1801±642 vs.4周910±213mOsm/kg H2O,P＜0.05;0周180

10、1±642 vs.8周860±233mOsm/kg H2O,P＜0.05)顯著下降。Realtime PCR方法觀察到心肌組織Corin和ANP mRNA表達(dá)在第4周顯著增加，分別為31.9倍(P=0.005)和180.7倍（P=0.030），第8周時(shí)與對照組無差異。
　　Realtime PCR方法觀察到DOCA-Salt小鼠心肌組織腺苷合成酶CD73 mRNA表達(dá)從第4周起顯著上調(diào)（4周18.79倍，P=0.001;8周8.2

11、8倍，P=0.036），A1ARmRNA第8周開始出現(xiàn)顯著上調(diào)（12.12倍，P=0.013），但Western Blot方法沒有觀察到A1AR蛋白表達(dá)水平的顯著變化。
　　3.A1AR在DOCA-Salt小鼠心臟損害中的作用建立A1AR-/-DOCA-Salt小鼠模型，觀察到A1AR-/-DOCA-Salt小鼠心率隨實(shí)驗(yàn)周數(shù)下降（4周636±64.2 vs.0周696.7±35.2，P＜0.05），平均動脈壓無顯著變化。24h尿

12、量相對于野生型實(shí)驗(yàn)組顯著增加(7003±3742 vs.3606±2359μl，P＜0.05)，24h尿鈉排出量較對照增加（1246.5±859.8 vs.146.6±71.2μmol/d, P＜0.05），尿滲透壓較對照下降（702±165 vs.1394±397mOsm/kg，P＜0.05）。心肌組織ANPmRNA表達(dá)顯著上調(diào)（12.65倍，P=0.026），Corin mRNA表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組與對照組間無差異。
　　A1AR-/

13、-DOCA-Salt小鼠第4周心臟重量指數(shù)及左心室厚度無顯著變化;心肌組織微血管密度無顯著升高;心肌巨噬細(xì)胞浸潤程度、CCL2 mRNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組與對照組間無差異;僅1只（共6只）小鼠心臟出現(xiàn)局灶性間質(zhì)纖維化，TGF-β1和Collagen1 mRNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組與對照組間無差異。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)條件下
　　1.DOCA-Salt小鼠血壓升高，心率下降，早期（4周）心臟微血管密度顯著增加、出現(xiàn)局灶性間質(zhì)纖維化，晚

14、期（8周）心臟重量指數(shù)顯著增加。結(jié)合前期研究觀察到腎臟損害，DOCA-Salt小鼠存在心腎共同損害，可作為慢性CRS模型。
　　2.DOCA-Salt小鼠血壓升高，提示存在水鈉潴留，其水鹽負(fù)荷受到相關(guān)因素調(diào)節(jié):心臟CD73-A1AR和Corin-ANP通路激活，ANP限制水和鈉的重吸收;24h尿量和24h尿鈉排出量顯著增加;前期研究觀察到腎臟CD73-A1AR通路激活，提示管球反饋持續(xù)激活。A1AR-/-DOCA-Salt小鼠管球