瞬時(shí)受體電位錨蛋白1在慢性咳嗽中的表達(dá)及作用機(jī)制初探.pdf

1、慢性咳嗽是內(nèi)科門診最常見的癥狀之一，常見病因包括嗜酸粒細(xì)胞性支氣管炎、咳嗽變異性哮喘、胃食道反流性咳嗽、上氣道咳嗽綜合征等，慢性咳嗽病因診斷明確后，大部分患者均得到有效的治療，但仍有部分病人經(jīng)過系列全面的檢查后，未能發(fā)現(xiàn)異常，病因不能明確，咳嗽持續(xù)存在，既往稱為慢性特發(fā)性咳嗽、不明原因慢性咳嗽、難治性咳嗽等，這部分患者病因不明，咳嗽敏感性增高是共同特征，組織病理、氣道炎癥等均無特異性，也無特異性標(biāo)記物。
　　咳嗽敏感性增高是慢性咳

2、嗽患者的主要特征之一，表現(xiàn)為對(duì)油煙、刺激性氣味、冷空氣等異常敏感，但化學(xué)性咳嗽敏感性（如辣椒素、檸檬酸等）檢測(cè)僅部分患者陽性，可能存在其他誘發(fā)咳嗽的途徑。
　　近年發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)受體電位陽離子通道(transient receptor potential canonical channels，TRP)家族成員瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid1，TRPV1)（辣椒素受

3、體）參與了慢性咳嗽的發(fā)生機(jī)制，慢性咳嗽患者氣道TRPV1表達(dá)增加，并與辣椒素咳嗽敏感性相關(guān)。
　　瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（transient receptor potential ankyrin1，TRPA1）是TRP家族另一成員，常常與TRPV1共同表達(dá)于迷走神經(jīng)纖維，吸入選擇性TRPA1激動(dòng)劑肉桂醛、異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC)等引起豚鼠和健康志愿者咳嗽， TRPA1可能也參與了慢性咳嗽的

4、發(fā)生機(jī)制。
　　通常認(rèn)為咳嗽感受器在咽喉部、氣管隆突分布最多，敏感性最高，臨床上慢性咳嗽患者常表現(xiàn)為胸外氣道和咽喉對(duì)局部刺激咳嗽敏感性增強(qiáng)，合并咽喉炎樣癥狀，如咽喉或咽喉下發(fā)癢、異物感、頻繁清喉等，可因說話唱歌、冷空氣、煙霧等誘發(fā)咳嗽。
　　最初的研究認(rèn)為TRP在神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)纖維上表達(dá)，TRPA1的研究也主要針對(duì)神經(jīng)組織或神經(jīng)元進(jìn)行，隨著研究的深入，許多非神經(jīng)組織、細(xì)胞也有TRPA1的表達(dá)，如肺部以及支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)

5、胞等，TRPA1在這些非神經(jīng)細(xì)胞上的功能尚不清楚。
　　香煙煙霧可以引起咳嗽等呼吸道癥狀，香煙煙霧及其主要成分丁烯醛、丙烯醛可以激動(dòng)辣椒素敏感的神經(jīng)元，這種反應(yīng)可以被TRPA1拮抗劑HC030031抑制，但不受TRPV1拮抗劑辣椒平影響。人與嚙齒類的TRPA1功能不完全相同，煙霧能否激活人TRPA1，長期煙霧暴露對(duì)TRPA1的功能有無影響，目前尚不明確。
　　因此，本研究擬探討TRPA1介導(dǎo)的化學(xué)性刺激咳嗽激發(fā)試驗(yàn)方法，觀察

6、慢性咳嗽患者TRPA1介導(dǎo)的咳嗽敏感性變化以及與TRPV1介導(dǎo)的咳嗽敏感性之間的關(guān)系；并觀察慢性咳嗽患者氣道不同部位黏膜TRPA1的表達(dá)情況；在體外實(shí)驗(yàn)部分，檢測(cè)香煙濃集物CSC刺激后氣道上皮細(xì)胞TRPA1mRNA及蛋白的表達(dá)，以及檢測(cè)香煙刺激后TRPA1-HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，了解CSC對(duì)TRPA1表達(dá)及功能的影響。
　　第一部分慢性咳嗽患者TRPA1介導(dǎo)咳嗽敏感性檢測(cè)及與TRPV1介導(dǎo)咳嗽敏感性的關(guān)系
　　研

7、究目的
　　探討TRPA1介導(dǎo)的異硫氰酸烯丙酯（AITC）咳嗽激發(fā)試驗(yàn)方法，觀察慢性咳嗽患者TRPA1化學(xué)刺激咳嗽敏感性的變化以及與TRPV1介導(dǎo)的辣椒素（CAP）咳嗽敏感性之間的關(guān)系。
　　研究對(duì)象
　　慢性咳嗽患者81例及29例健康志愿者。
　　研究方法
　　1.慢性咳嗽患者根據(jù)年齡分為青年組（<45歲），中老年組（≥45歲）。
　　2.受試者入選后先進(jìn)行AITC咳嗽激發(fā)，間隔2~3天后進(jìn)行辣椒素

8、咳嗽激發(fā)試驗(yàn)。
　　3.咳嗽激發(fā)試驗(yàn)：采用定量吸入法，激發(fā)液濃度逐漸遞增，AITC激發(fā)液分別為31.3，62.5，125，250，375，500，750，1000mmol/L；CAP激發(fā)液濃度：1．95~1000μmol/L。當(dāng)吸入激發(fā)液后30秒內(nèi)出現(xiàn)5次或5次以上咳嗽，終止試驗(yàn)，分別記錄出現(xiàn)2、5次咳嗽的濃度即C2、C5，結(jié)果以C2、C5的對(duì)數(shù)即LgC2、LgC5表示。
　　結(jié)果
　　1.慢性咳嗽患者青年組及中老年組

9、兩組臨床特征無顯著性差異。
　　2.慢性咳嗽組、正常對(duì)照組的 AITC5次咳嗽成功激發(fā)率分別是92.60％、93.10%。
　　3.不良事件： AITC激發(fā)不良事件發(fā)生率7.27%，表現(xiàn)為激發(fā)時(shí)咳嗽劇烈、胸悶（2.72%），其中2例休息好轉(zhuǎn)，另1例喉部出現(xiàn)喘鳴音，經(jīng)吸入萬托林200μg好轉(zhuǎn)；惡心（3.63%），頭暈（0.09%），停止激發(fā)后自行好轉(zhuǎn)。
　　4.慢性咳嗽組AITC LgC5較健康對(duì)照組低[2.57(0.6

10、0)vs2.70(0.30)]，差異有顯著性 p<0.05), AITC LgC2兩組之間差異無顯著性[2.40(1.05) vs2.40(0.60)]（p>0.05）。慢性咳嗽組CAP LgC2，LgC5較正常對(duì)照組低，1.04(1.50)vs1.89(1.51)，1.94(1.50)vs3.00(0.38)，差異有顯著性p<0.05。
　　5.青年組、中老年組 AITC LgC2、 LgC5均無顯著性差異，[2.40(0.98

11、)vs2.40(0.90)，2.57（0.6）vs2.57（0.60）]，CAP LgC2、LgC5均無顯著性差異0.89(1.50)vs1.19(1.50)，1.79(1.50)vs2.09(1.35)，（p>0.05）。
　　6.女性慢性咳嗽患者的AITC LgC2及LgC5低于男性患者[0.44(0.30) vs1.04(1.95),1.64(1.35) vs2.69(0.99)]，p<0.05)；女性患者CAP LgC2較

12、男性患者顯著性降低，[0.44(1.20)vs1.34(1.88)]，p<0.05。
　　7. AITC LgC2與CAP LgC2的相關(guān)系數(shù)為0.069， AITC LgC5與CAP LgC5的相關(guān)系數(shù)為0.065，相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05)。
　　8.本組同時(shí)完成AITC及CAP咳嗽敏感性檢測(cè)的66例慢性咳嗽患者中，AITC與CAP咳嗽敏感性增高的陽性率是分別是42.43%、57.58%，聯(lián)合兩種檢測(cè)方法，咳嗽

13、敏感性增高的慢性咳嗽患者達(dá)74.25%。
　　結(jié)論
　　1.慢性咳嗽患者AITC咳嗽敏感性增高。
　　2. AITC咳嗽敏感性與CAP敏感性不相關(guān)，AITC咳嗽激發(fā)試驗(yàn)可作為辣椒素咳嗽激發(fā)試驗(yàn)的一個(gè)補(bǔ)充。
　　第二部分慢性咳嗽患者氣道黏膜TRPA1的表達(dá)
　　研究目的
　　了解慢性咳嗽患者TRPA1在氣道不同部位黏膜的表達(dá)。
　　研究方法
　　1.收集慢性咳嗽患者氣道不同部位（咽、氣管上段

14、、隆突、右上葉支氣管）黏膜活檢組織。
　　2.免疫熒光法檢測(cè)氣道黏膜TRPA1的表達(dá)。
　　3.圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0分析氣道黏膜組織TRPA1，計(jì)算每張切片的平均熒光強(qiáng)度（總熒光強(qiáng)度/總面積）。
　　結(jié)果
　　1.入選健康對(duì)照組9例，男5例，女4例；慢性咳嗽患者33例，男20例，女13例，兩組年齡無顯著性差異；共收集慢性咳嗽組咽后壁黏膜15份，氣管上段黏膜17份，隆突黏膜19份，右上葉支

15、氣管黏膜25份；正常對(duì)照組氣道部位隆突黏膜3份，右上葉支氣管黏膜9份。
　　2. TRPA1表達(dá)定位于氣道上皮及上皮下間質(zhì)、血管壁、平滑肌、部分炎癥細(xì)胞等，主要是在胞膜上表達(dá)，部分胞漿也有表達(dá)。
　　3.慢性咳嗽患者平均氣道黏膜TRPA1熒光強(qiáng)度0.062（0.126）高于正常對(duì)照組0.008（0.023），差異有顯著性，p<0.05。
　　4.慢性咳嗽組氣道各部位黏膜TRPA1的平均熒光強(qiáng)度差異無顯著性，p>0.05

16、。
　　5.辣椒素高敏組慢性咳嗽患者氣道黏膜 TRPA1的熒光強(qiáng)度[0.081（0.117）]高于常敏組[0.034（0.110）]及正常對(duì)照組[0.011（0.011）]，常敏組[0.034（0.110）]亦高于正常對(duì)照組[0.011（0.011）]，差異均有顯著性，p<0.05。
　　6.男性及女性慢性咳嗽患者氣道TRPA1的平均熒光強(qiáng)度分別為0.047（0.110），0.057（0.096），差異無顯著性，p>0.05

17、。
　　7.病因明確組與不明原因組氣道不同部位 TRPA1的表達(dá)無顯著性差異,[0.052(0.057) vs0.072(0.073)], p>0.05。
　　8.慢性咳嗽患者氣道TRPA1的平均熒光強(qiáng)度與辣椒素咳嗽閾值及AITC咳嗽閾值(LgC2,LgC5)的相關(guān)性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　1.慢性咳嗽患者氣道黏膜TRPA1的表達(dá)升高。
　　2.除TRPV1外，TRPA1可能也參與了慢性咳嗽的發(fā)生機(jī)

18、制。
　　第三部分香煙濃集物對(duì)TRPA1表達(dá)及功能的影響
　　分題1：香煙濃集物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞TRPA1/TRPV1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　研究目的
　　了解香煙濃集物對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞TRPA1/TRPV1 mRNA表達(dá)的影響。
　　研究方法
　　1.不同濃度香煙濃集物（CSC）刺激人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）24，48小時(shí)后，熒光定量PCR法及蛋白免疫印跡法分別檢測(cè)TRPA1/TRP

19、V1 mRNA及蛋白的表達(dá)量。
　　2.熒光定量PCR法觀察TRPA1拮抗劑HC030031對(duì)CSC刺激16HBE后TRPV1 mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果
　　1.與陰性對(duì)照（未刺激細(xì)胞組）比較，CSC100μg/ml刺激16HBE24小時(shí)后TRPA1 mRNA表達(dá)顯著升高。
　　2.與陰性對(duì)照（未刺激細(xì)胞組）比較，不同濃度 CSC刺激16HBE48小時(shí)后TRPA1 mRNA表達(dá)顯著升高。
　　3. C

20、SC刺激16HBE24及48小時(shí)后TRPV1 mRNA表達(dá)無顯著變化。
　　4.拮抗劑HC030031與CSC共同刺激16HBE24或48小時(shí)后，TRPA1 mRNA表達(dá)無顯著變化，
　　5. CSC刺激16HBE細(xì)胞24及48小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞TRPA1及TRPV1的蛋白表達(dá)均無影響。
　　結(jié)論
　　1. CSC可以使氣道上皮細(xì)胞 TRPA1mRNA表達(dá)增加，但 TRPA1拮抗劑HC030031對(duì)該效應(yīng)無抑制作用。

21、
　　2. CSC對(duì)氣道上皮細(xì)胞TRPV1mRNA的表達(dá)無影響。
　　3. CSC對(duì)TRPA1、TRPV1蛋白表達(dá)無明顯影響。
　　分題2香煙濃集物對(duì)人TRPA1通道功能的影響
　　研究目的
　　通過檢測(cè)香煙濃集物(CSC)刺激轉(zhuǎn)染人TRPA1的HEK293(TRPA1-HEK293)細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，觀察較長時(shí)間CSC暴露對(duì)TRPA1通道的作用。
　　研究方法
　　1. CSC分別與細(xì)胞

22、孵育24或48小時(shí)。
　　2. Fura-2-AM標(biāo)記測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子法測(cè)量細(xì)胞的基礎(chǔ)鈣及外源性細(xì)胞鈣內(nèi)流,拮抗劑HC030031在檢測(cè)前30分鐘加入
　　結(jié)果
　　1. CSC刺激24小時(shí)，CSC可使穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TRPA1的HEK293（TRPA1-HEK293）細(xì)胞基礎(chǔ)鈣及外源性細(xì)胞鈣內(nèi)流增加，并呈濃度依賴性，在未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞未見此現(xiàn)象。
　　2. CSC刺激48小時(shí)后，濃度依賴性地使TRPA1-HEK