嗜水氣單胞菌CphA酶與碳青霉烯類抗生素之間的分子識(shí)別和相互作用.pdf

1、金屬β-內(nèi)酰胺酶(Metallo-beta lactamase，MβLs)通過(guò)水解β-內(nèi)酰胺抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)而阻止抗生素對(duì)抗細(xì)菌感染的有益行為。來(lái)自于嗜水氣單胞菌的CphA酶是MβLs亞群的一員，其在活性位點(diǎn)只有一個(gè)Zn2+，并只特異性水解碳青霉烯類抗生素。然而對(duì)于CphA酶與碳青霉烯類抗生素之間的分子識(shí)別和相互作用知之甚少。本研究將在重組菌中表達(dá)并分離純化得到CphA酶的基礎(chǔ)上，采用熒光光譜法和分子對(duì)接模擬法相結(jié)合，以亞胺培南(i

2、mipenem，IMP)和比阿培南(biapenem，BIA)為研究對(duì)象，研究它們?cè)诮Y(jié)合過(guò)程中，酶的構(gòu)象變化、抗生素分子的空間分布取向、形成絡(luò)合物的本質(zhì)以及它們之間的作用力類型和作用位點(diǎn)數(shù)等。
　　(1)將含有pET28b-CphA的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)陽(yáng)離子交換層析分離純化，然后用SDS-PAGE鑒定和Bradford測(cè)蛋白含量，最后對(duì)其進(jìn)行熒光表征。結(jié)果表明:得到有活性的純度較高的樣品，其分子量約為28

3、KDa，純化后產(chǎn)量約為0.18～0.21mg/mL，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為278nm時(shí)，發(fā)現(xiàn)在336.2nm處熒光明顯。
　　(2)在277K、pH7.4PBS中，測(cè)得CphA酶對(duì)IMP與BIA的Km分別為356μM和286μM;通過(guò)熒光發(fā)射光譜測(cè)得CphA酶與IMP和BIA的分子飽和比分別為0.95和0.98;同步熒光光譜結(jié)果表明:它們相互作用且Tyr殘基附近的微環(huán)境發(fā)生微弱的變化;測(cè)定277K、281K和285K三個(gè)溫度下CphA酶分別

4、對(duì)IMP和BIA結(jié)合過(guò)程的猝滅光譜，結(jié)果表明:它們之間發(fā)生的猝滅均為靜態(tài)猝滅;它們之間是依靠單一的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，且均為自發(fā)的放熱過(guò)程。
　　(3)分子對(duì)接結(jié)果顯示CphA酶與IMP和BIA在結(jié)合過(guò)程中存在一些相同之處:兩種抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)的C3羧基氧直接與Zn2+形成金屬配位鍵，促進(jìn)相互作用，且均使CphA酶loop環(huán)發(fā)生局部的構(gòu)象變化。不同之處為:IMP因側(cè)鏈空間位阻較小，使其全部進(jìn)入口袋，在相互作用過(guò)程中，共有3組靜電力和5

5、組氫鍵形成;BIA因側(cè)鏈雙環(huán)三唑的位阻比較大，留部分側(cè)鏈位于口袋外側(cè)，在相互作用過(guò)程中，共有4組靜電力和2組氫鍵，進(jìn)而使得CphA酶對(duì)BIA的親和力大于對(duì)IMP的，以及形成CphA-BIA復(fù)合物的穩(wěn)定性也夫于CphA-IMP復(fù)合物的穩(wěn)定性。熒光光譜結(jié)果中CphA-BIA復(fù)合物體系的Ksv和Ka高于CphA-IMP復(fù)合物體系的，也證實(shí)這一推斷。另外，對(duì)接結(jié)果顯示復(fù)合物體系△G為負(fù)值，表明兩個(gè)復(fù)合物的形成均屬于自發(fā)的放熱過(guò)程，與前期熱力學(xué)結(jié)