脆弱擬桿菌CcrA酶與頭孢菌素類(lèi)抗生素之間的分子識(shí)別和相互作用.pdf

1、超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)使得臨床上使用的多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素失效，這主要是因?yàn)槠淇梢援a(chǎn)生一種水解抗生素的金屬β-內(nèi)酰胺酶，脆弱擬桿菌產(chǎn)生的金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA是一種典型的金屬酶，但目前對(duì)其與該類(lèi)抗生素之間的結(jié)合過(guò)程研究比較少，對(duì)此，本研究采用實(shí)驗(yàn)測(cè)定和理論預(yù)測(cè)相結(jié)合的方法，進(jìn)行對(duì)金屬β-內(nèi)酰胺酶CcrA與頭孢噻肟(CTX)和頭孢他啶(CAZ)之間分子識(shí)別和相互作用機(jī)理的研究，主要內(nèi)容如下:
　　1.在大腸桿菌中對(duì)金屬β-內(nèi)酰酶CcrA

2、進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)鎳離子親和層析法實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的分離純化，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定，最后通過(guò)Bradford法測(cè)定蛋白的含量。結(jié)果表明，該過(guò)程實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的蛋白CcrA的高效表達(dá)，且純化后CcrA酶的純度較高，蛋白含量為0.26-0.28mg/mL。
　　2.利用熒光光譜法對(duì)CcrA酶與兩種頭孢菌素類(lèi)抗生素（CTX和CAZ）之間的分子識(shí)別和相互作用進(jìn)行研究。測(cè)定了三個(gè)溫度下(277K、281K、2

3、85K)抗生素和CcrA酶相互作用的熒光光譜，獲得了二者結(jié)合過(guò)程中的熒光猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq、結(jié)合常數(shù)Ka、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n以及結(jié)合過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種抗生素與CcrA酶之間發(fā)生的猝滅均為靜態(tài)猝滅;在相同溫度下，CcrA酶與CTX結(jié)合體系的Ksv和Kq均大于CcrA酶與CAZ結(jié)合體系，且CcrA酶與CTX結(jié)合體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n也比較大，這表明CcrA酶與CTX的結(jié)合能力大于CcrA酶與CAZ，同

4、時(shí)也表明，結(jié)合過(guò)程生成的CcrA-CTX復(fù)合物穩(wěn)定性比較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，CcrA酶與兩種抗生素在結(jié)合過(guò)程中的吉布斯自由能、焓變等均為負(fù)值，表明CcrA酶與CTX、CAZ之間的相互作用是一個(gè)自發(fā)、放熱的過(guò)程。
　　3.通過(guò)分子對(duì)接模擬方法研究了在CcrA酶與CTX、CAZ之間相互識(shí)別和作用過(guò)程中，酶分子內(nèi)氨基酸殘基和小分子配體中官能團(tuán)的相互作用模式。分析發(fā)現(xiàn)位于酶分子活性口袋附近的loop環(huán)柔性變化較大，表明二者在相互作用過(guò)程中，