黃瓜性別決定基因M的精細(xì)定位及轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析.pdf

1、性別分化是植物的基本發(fā)育過(guò)程，由于作物的性別表達(dá)類(lèi)型決定了其育種和栽培的方式，所以控制性別表達(dá)具有重要經(jīng)濟(jì)意義，黃瓜(Cucumis Sativus L.)具有非常豐富的性別表現(xiàn)類(lèi)型，是研究植物性別表達(dá)的模式植物。黃瓜花有雄花、雌花和兩性花三種類(lèi)型，但幼花蕾最初都是兩性花原基，在進(jìn)一步發(fā)育中兩性花原基中雄蕊的滯育形成雌花，雌蕊的滯育形成雄花，雄蕊和雌蕊都發(fā)育則形成兩性花。目前已經(jīng)明確控制黃瓜性別表達(dá)的主效基因位點(diǎn)有F、M和A三個(gè)。除遺傳

2、因素外，黃瓜性別表達(dá)還受環(huán)境和激素的調(diào)控，長(zhǎng)日照、高溫、赤霉素促進(jìn)雄花產(chǎn)生，而短日照、低溫、乙烯則促進(jìn)雌花形成。激素在黃瓜的性別表達(dá)中起重要作用。黃瓜性別表達(dá)的乙烯控制模型認(rèn)為：乙烯既促進(jìn)雌蕊發(fā)育，又抑制雄蕊發(fā)育。該模型推斷，F(xiàn)基因的產(chǎn)物控制乙烯在黃瓜植株分布的部位和濃度，促進(jìn)雌性的表達(dá)；而M基因的產(chǎn)物則控制乙烯信號(hào)的識(shí)別，在乙烯濃度高于閾值時(shí)抑制雄蕊的發(fā)育。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)該模型提供了實(shí)驗(yàn)支持：F基因已被克隆，為乙烯合成酶基因家族成

3、員之一，符合其控制乙烯濃度功能的預(yù)測(cè)；M位點(diǎn)直接介導(dǎo)了乙烯誘導(dǎo)的雄蕊滯育。要進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的真實(shí)性，必須要克隆M基因，而M基因的精細(xì)定位則是該基因克隆的前提。 本研究以近等基因系WI1983G(雌性株，基因型為MMFF)和WI1983H(兩性花株，基因型為mmFF)、F1、F2和BC1為材料，通過(guò)M基因的精細(xì)定位以及轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析，為圖位克隆M基因、研究其功能奠定基礎(chǔ)。而后者又為進(jìn)一步深入了解乙烯在黃瓜性別表達(dá)過(guò)程的作用機(jī)理，

4、揭示葫蘆科作物性別表達(dá)的進(jìn)化史，乃至通過(guò)基因工程操縱其它作物的性別表達(dá)來(lái)加速雜種優(yōu)勢(shì)的利用提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下： 1.近等基因系親本W(wǎng)I1983G全為雌花，WI1983H全為兩性花，它們的雜交組合F1代群體單株均開(kāi)單性雌花(性型表現(xiàn)為雌性株)，單性花對(duì)兩性花為顯性性狀。該雜交組合的F2代群體單株的性型分離株數(shù)統(tǒng)計(jì)表明：638株F2單株當(dāng)中，其中雌性株473株，兩性花株165株，經(jīng)卡平方測(cè)驗(yàn)，F(xiàn)2代雌性株與兩性花株的比例符合

5、3:1的分離比(X2=0.38；p>0.5)；BC1代群體751個(gè)單株當(dāng)中，雌性株373株，兩性株378株，符合1:1的分離比(X2=0.03；p>0.95)，表明兩性花是由單基因控制。 2.采用高通量AFLP技術(shù)，共獲得4個(gè)與M基因緊密連鎖的AFLP分子標(biāo)記，其中PGGMCCC450/453和PGTMCTA-185分別位于M基因的兩側(cè)，共跨度約5 cM。離M基因最近的側(cè)翼標(biāo)記EACAMCAT_202/203和EATGMCAA3

6、80與M基因的遺傳距離分別是0.9和1.6 cM，最終將M基因定位在2.5 cM以內(nèi)。 3.利用M基因的側(cè)翼標(biāo)記PGGMCCC_450/453和PGTMCTA_185，從1984株F2和751個(gè)BC1分離群體中篩選出重組單株，然后通過(guò)896對(duì)AFLP引物組合、2000對(duì)SSR引物(來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所功能基因組實(shí)驗(yàn)室黃瓜基因組項(xiàng)目)及CAPS(根據(jù)黃瓜基因組項(xiàng)目Superscaff序列信息)篩選分析，共獲得了AFL

7、P標(biāo)記6個(gè)、SSR標(biāo)記8個(gè)、SCAR標(biāo)記2個(gè)和CAPS標(biāo)記1個(gè)，從而構(gòu)建了M基因的精細(xì)遺傳圖譜。M基因側(cè)翼最近的兩個(gè)標(biāo)記SSR23487和S ME8SA7與M基因之間的遺傳距離均為0.1cM，最終將M基因定位在0.2 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)。另外，通過(guò)染色體步移法開(kāi)發(fā)出了一個(gè)SNP標(biāo)記SN1，該標(biāo)記在2，080個(gè)F2和751個(gè)BC1分離群體當(dāng)中沒(méi)有發(fā)生重組事件，也即SN1與M基因共分離。 4.對(duì)近等基因系(WI1983G和WI1983

8、H)的雌花和兩性花cDNA分別進(jìn)行EST測(cè)序，其中雌花199，032條，兩性花176，139條。經(jīng)Phred/Phrap/Consed軟件包聚類(lèi)拼接后共獲得一致性序列(contig)23，627條，雌花和兩性花的單一序列(singlet)分別是32,521和33，494條。經(jīng)Blast比對(duì)(Nr非冗余數(shù)據(jù)庫(kù))、IDEG.6分析軟件的卡平方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1，256個(gè)Unigene的表達(dá)量在雌花和兩性花間存在顯著性差異(p<0.05).這些差異

9、表達(dá)基因涉及到物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及脅迫相關(guān)等諸多方面。此外，還有一些基因功能未知。 對(duì)雌花和兩性花間表達(dá)差異顯著的1，256個(gè)Unigene進(jìn)行功能注釋和GO分類(lèi)。它們被注釋的基因?yàn)?35個(gè)，按照GO分類(lèi)結(jié)果如下：細(xì)胞組分，108條，占36％，主要涉及到細(xì)胞核、細(xì)胞膜、線粒體等6類(lèi)組分；分子功能，155條，占51％，表現(xiàn)出7類(lèi)分子活性；生物學(xué)過(guò)程，39條，占13％，涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成、代謝等過(guò)程。 以近等