鄱陽(yáng)湖流域并殖吸蟲(chóng)宿主動(dòng)物華溪蟹屬淡水蟹類DNA條形碼的初步研究.pdf

1、目的：探討運(yùn)用DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行鄱陽(yáng)湖流域并殖吸蟲(chóng)宿主動(dòng)物華溪蟹屬淡水蟹類分類鑒定的可行性，為淡水蟹分類鑒定提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的分子分類參照模式。
　　方法：根據(jù)不同取材部位對(duì)DNA提取效果的影響，優(yōu)化華溪蟹屬淡水蟹類DNA的提取。根據(jù)華溪蟹屬物種間地理分布、生境模式的差異性，選取分布于鄱陽(yáng)湖流域的福建華溪蟹（Sinopotamon fukienense）、萬(wàn)載華溪蟹（S. wanzaiense）、修水華溪蟹（S. xiushu

2、iense）、斜緣華溪蟹（S. obliquum）、蘭氏華溪蟹（S. lansi）以及資溪華溪蟹（S.zixiense）6個(gè)代表性物種，采用線粒體COI、16S rDNA基因片段以及核基因片段ITS2作為分子標(biāo)記，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中同屬序列片段，經(jīng)DNA提取、引物篩選、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)處理和分析，在計(jì)算得到的遺傳距離和所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行華溪蟹DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的選擇。
　　結(jié)果：使用試劑盒法提取

3、華溪蟹屬淡水蟹類步足肌肉，DNA提取濃度可達(dá)30 ng/μL，DNA提取效果穩(wěn)定可靠。在本實(shí)驗(yàn)涉及的淡水蟹類個(gè)體及類群的識(shí)別上，選擇16S rDNA基因片段作為DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因，對(duì)DNA模板的完整性等質(zhì)量要求較高，陳舊樣本提取的DNA無(wú)法保證理想的PCR擴(kuò)增效率；而ITS2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳則顯示種間序列存在長(zhǎng)度多態(tài)性。故16S rDNA和ITS2基因片段不適宜作為華溪蟹類物種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因。COI基因片段擴(kuò)增效率為100％

4、，擴(kuò)增效果最為穩(wěn)定，且測(cè)序結(jié)果分析大小一致，無(wú)插入及缺失，結(jié)合GenBank部分華溪蟹屬序列數(shù)據(jù)分析，可區(qū)分本次研究所涉及的75％的物種，提示COI基因片段較16S rDNA、ITS2基因更適合作為鑒定華溪蟹類物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列。
　　結(jié)論：
　　1.使用試劑盒法提取華溪蟹屬淡水蟹類步足肌肉，可獲得穩(wěn)定可靠的DNA提取效果。
　　2.COI基因片段較16S rDNA、ITS2基因更適合作為鑒定華溪蟹類物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)

5、序列，可作為華溪蟹屬淡水蟹類物種鑒定的輔助分類工具。
　　3.研究涉及的COI基因片段序列A、T含量高達(dá)66.0%，有AT偏向，呈現(xiàn)后生動(dòng)物線粒體基因典型的AT偏好特點(diǎn)。
　　4. COI基因片段序列實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)計(jì)算建立的分支樹(shù)顯示：本次實(shí)驗(yàn)測(cè)序的S. fukienense與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的AB433578.1（S. fukienense COI基因片段）分為與其他7種華溪蟹無(wú)交叉的2支，若AB433578.1定種準(zhǔn)

6、確，提示極有可能在標(biāo)本的補(bǔ)充采集及形態(tài)學(xué)測(cè)量比對(duì)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)隱存物種（亞種）。
　　5.基于S. lansi COI基因數(shù)據(jù)建立的分支樹(shù)，顯示贛東、贛北、贛中地區(qū)S. lansi先與湖北地區(qū)S. lansi并系為一支，該支進(jìn)而與贛西、贛南地區(qū)S. lansi形成并系，并未顯示出長(zhǎng)江對(duì)S. lansi的地理阻隔作用，反而顯示S. lansi種群沿大小水系擴(kuò)散現(xiàn)象，結(jié)合S. lansi主要生活在大型河流、湖泊生境，及體型較大、活動(dòng)能力強(qiáng)