區(qū)分成像細胞質(zhì)膜內(nèi)脂筏與非脂筏微疇以及專一檢測細胞內(nèi)微環(huán)境的新型熒光探針的研制.pdf

1、細胞內(nèi)的各種微結(jié)構(gòu)與微環(huán)境在復雜的生命過程中起著至關(guān)重要的作用。脂筏和非脂筏微區(qū)是細胞膜上的兩種重要的微結(jié)構(gòu)，脂筏微區(qū)在信號轉(zhuǎn)導、病毒侵入、胞吞胞吐、蛋白簇的形成等重要的生理、病理過程中起著重要的作用;非脂筏微區(qū)上載有與免疫功能相關(guān)的蛋白，與免疫過程、膽固醇穩(wěn)態(tài)調(diào)控等重要過程有密切聯(lián)系。此外，非脂筏微區(qū)的失調(diào)與動脈粥化等心腦疾病相關(guān)，老年癡呆癥會引發(fā)脂筏微區(qū)和非脂筏微區(qū)共同發(fā)生變化。pH值是細胞內(nèi)微環(huán)境的重要參量，它與蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變、酶催

2、化效率有直接關(guān)聯(lián)，為了維持正常的生理功能，細胞質(zhì)和線粒體、溶酶體這些細胞器內(nèi)的pH值一直保持在很窄的變化范圍內(nèi)。pH值的異常會導致細胞病變甚至凋亡，也是許多疾病包括癌癥的重要特征之一。黏度是決定生物化學反應(yīng)中的能量和物質(zhì)傳遞速率的重要因素，也能直接影響和調(diào)控某些生物化學反應(yīng)的速率。特別是在酶促反應(yīng)以及涉及到蛋白之間相互作用或跨膜運輸?shù)姆磻?yīng)中，黏度起著至關(guān)重要的作用。細胞內(nèi)黏度的異常與動脈粥化、糖尿病、老年癡呆癥甚至腫瘤等疾病有密切聯(lián)系。

3、因此對細胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的原位、實時觀測有著重要的生理學、病理學和診斷價值。
　　熒光成像方法在成像、監(jiān)測細胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)、微環(huán)境方面有著獨特優(yōu)勢和重要應(yīng)用。相比于探測微電極、原子力顯微鏡、掃描電鏡等方法，熒光成像法可以近乎無損地對活細胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)與微環(huán)境進行原位、實時、動態(tài)觀測，這也是生物研究中最需要的。因此對細胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)、微環(huán)境的熒光成像，以及相應(yīng)的熒光探針得到了廣泛的研究與發(fā)展。例如，人們使用極性敏感的熒光染料改造為能夠雙色成像

4、脂筏、非脂筏微區(qū)的熒光探針;用黏度敏感染料改造為成像脂筏微區(qū)的熒光探針;利用分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(Intromolecular Charge Transfer, ICT)、光誘導的能量轉(zhuǎn)移(Photo-induced Energy Transfer, PET)等原理設(shè)計了pH值探針;利用黏度敏感的轉(zhuǎn)子型熒光染料對細胞內(nèi)黏度進行了探測，等等。盡管人們已經(jīng)做出了大量工作來開發(fā)、完善這些這些探針，但是它們在生物成像的應(yīng)用中依舊均面臨著各種限制。例如

5、，目前用于雙色成像細胞膜上脂筏、非脂筏微區(qū)的探針對兩種微區(qū)的區(qū)分力不夠，導致了它們在活細胞膜上很難清晰成像兩種微區(qū)的精確分布;比例型pH值探針對酸堿環(huán)境的區(qū)分力不足，導致了在比例成像過程中雙通道收集熒光面臨一些困難;等等。因此，為了突破這些瓶頸問題，對目前的熒光探針進行改進，特別開發(fā)基于新原理的熒光探針至關(guān)重要。
　　為了克服極性探針在雙色區(qū)分成像脂筏、非脂筏微區(qū)時所面臨的區(qū)分度不夠的問題，我們利用在聚集態(tài)和單體態(tài)具有不同熒光顏色

6、的熒光染料，針對脂筏、非脂筏微區(qū)在磷脂排布方式上的不同，開發(fā)了聚集/單體型的熒光探針。脂筏微區(qū)的磷脂排布緊密且有序，非脂筏微區(qū)的磷脂排布松散且無序，因此許多熒光分子能夠嵌入非脂筏微區(qū)，卻不能進入脂筏微區(qū)。我們在熒光染料上引入兩個長烷基鏈，構(gòu)造并合成了兩個熒光探針2，7-9E-BHVC12和3，6-9E-BHVC12。體外囊泡測試結(jié)果表明，它們能夠嵌入松散排布的非脂筏微區(qū)，呈單體狀態(tài)，發(fā)射出黃色熒光;同時它們不能夠進入脂筏微區(qū)，長烷基鏈能

7、夠?qū)⑺麄冨^定在其表面并在脂筏磷脂的誘導下形成聚集體，發(fā)射出紅色熒光;從而以黃、紅兩種熒光雙色標記了脂筏、非脂筏微區(qū)。特別是，2，7-9E-BHVC12在兩種微區(qū)上的熒光波長差別高達110nm，遠高于目前已報導的基于極性原理的探針(不超過50nm)。因此，探針2，7-9E-BHVC12能夠以較高的區(qū)分度區(qū)分成像兩種微區(qū)，在活細胞的細胞膜上對這兩種微區(qū)進行了清晰雙色區(qū)分成像，并揭示了癌細胞和正常細胞膜上脂筏、非脂筏微區(qū)分布的差異。這些結(jié)果表

8、明探針2，7-9E-BHVC12具有巨大的應(yīng)用前景，而這種聚集/單體型探針的設(shè)計思路是合理、可行的，可以為接下來的相關(guān)探針開發(fā)提供參考。
　　另一方面，盡管目前已經(jīng)有繁多的pH值探針報導，大多數(shù)比例型的pH值探針對酸堿的區(qū)分度不夠(不超過100nm)，而且雙光子比例型的pH值探針報導較少。目前設(shè)計pH值探針的原理較為單一，是導致這一現(xiàn)狀的最主要原因。為了解決這一瓶頸性問題，我們以一種特殊的pH值調(diào)控的環(huán)化—開環(huán)反應(yīng)為基礎(chǔ)，以咔唑、

9、三苯胺、芘為母體，設(shè)計并合成了6個環(huán)化—開環(huán)型的熒光探針。這些探針在酸性條件下處于開環(huán)狀態(tài)，發(fā)射出長波長的熒光;在堿性條件下會發(fā)生環(huán)化閉環(huán)反應(yīng)，該反應(yīng)會切斷、縮減熒光團共軛體系，從而可以引發(fā)熒光團吸收和發(fā)射性質(zhì)的大幅度轉(zhuǎn)變。這6個熒光探針都能以兩種熒光波長實現(xiàn)對酸堿環(huán)境的區(qū)分，然而考慮到探針與共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡匹配性，我們篩選出2個雙光子比例探針和1個單光子比例型的探針對細胞內(nèi)的pH值進行檢測成像。此外，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的不同，這些

10、探針可以靶向線粒體或溶酶體，且具有不同的pKa值。因此，我們成功的使用這些探針對溶酶體內(nèi)的pH值進行了單、雙光子比例成像，對線粒體內(nèi)的pH值進行了單光子比例成像。特別是，6個熒光探針在酸堿條件下的熒光波長差異都在150nm以上，甚至能達到210nm;探針的染色位置和pKa值也可以通過分子結(jié)構(gòu)的調(diào)整而改變;因此，這種環(huán)化—開環(huán)反應(yīng)可以作為平臺來設(shè)計高襯度比例成像細胞內(nèi)pH值的單雙光子熒光探針。
　　轉(zhuǎn)子型的熒光染料具有對黏度響應(yīng)的性

11、質(zhì)，它們在低黏度的環(huán)境中具有微弱的熒光，在高黏度的環(huán)境中具有明亮的熒光。因此，這類熒光分子在高信噪比的成像細胞內(nèi)黏性結(jié)構(gòu)、成像細胞內(nèi)黏度變化等應(yīng)用上具有廣闊的發(fā)展前景。我們以具有強推電子能力的胺基為給電子基團，以具有強吸電子能力陽離子鹽結(jié)構(gòu)為吸電子基團，構(gòu)建并合成了三個具有D-π-A結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)子型熒光探針，R-、R-2和V-1。三個熒光染料都對黏度有明顯響應(yīng)，它們在低黏度的甲醇中熒光微弱，隨著甘油組分的增加，熒光明顯增強。其中R-1和R-

12、2對RNA有一定的結(jié)合力，可以在單雙光子顯微鏡下實現(xiàn)對核仁的高信噪比成像。此外，我們也在雙光子顯微鏡下，用R-2成功地對深層肌肉組織內(nèi)的核仁進行了成像。考慮到R-1和R-2可以檢測黏度的變化，它們有潛力對細胞或組織內(nèi)核仁的黏度變化進行監(jiān)測。探針V-1靶向細胞內(nèi)的線粒體，且對黏度檢測靈敏度較高（甘油中的熒光強度是甲醇中的60倍）。因此我們使用V-1在共聚焦顯微鏡下成功成像了制霉菌素處理所引起的SiHa細胞線粒體內(nèi)黏度的增加情況。探針V-1

13、可以應(yīng)用于原位觀測線粒體內(nèi)的黏度變化。
　　對pH值、黏度、極性惰性的單雙光子熒光染料可以作為平臺來進行熒光探針設(shè)計。因此，我們根據(jù)在環(huán)境敏感染料的設(shè)計與合成中得到的經(jīng)驗，設(shè)計了對環(huán)境惰性的小分子結(jié)構(gòu)的雙光子綠光染料。我們將弱給電子效應(yīng)的官能團和強吸電子效應(yīng)的結(jié)構(gòu)連接到簡單的共軛體系上，得到了具有小分子結(jié)構(gòu)，在低黏度、高極性溶劑中也具有一定量子產(chǎn)率的雙光子綠光染料。該染料具有一定的雙光子吸收截面(350GM)，且分子結(jié)構(gòu)小、膜通透

14、性好，因此具有很好的應(yīng)用前景。為了驗證染料分子在細胞成像中的應(yīng)用價值，我們在該染料分子的基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成了溶酶體和線粒體探針，并成功對細胞內(nèi)的溶酶體和線粒體進行了單、雙光子成像。兩個探針能夠在20分鐘內(nèi)透過細胞膜和細胞器膜并成功著色線粒體和溶酶體，證實了它們優(yōu)秀的膜通透性。另外，染料的毒性較低、單雙光子光穩(wěn)定性較好，是一個優(yōu)秀的探針設(shè)計平臺。而這種通過引入弱給電子效應(yīng)、強吸電子基團來實現(xiàn)雙光子長波長發(fā)射同時抑制TICT過程的設(shè)計思路可

15、以為單雙光子染料的構(gòu)建提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　總之，我們設(shè)計并合成了聚集/單體型探針，實現(xiàn)了雙色高襯度成像細胞膜上脂筏、非脂筏微區(qū);利用pH值依賴的環(huán)化一開環(huán)反應(yīng)，設(shè)計了對酸堿區(qū)分度高的pH值探針，實現(xiàn)了對溶酶體、線粒體內(nèi)pH值的單、雙光子比例型成像;設(shè)計并合成了分子轉(zhuǎn)子，實現(xiàn)了對細胞、組織內(nèi)核仁結(jié)構(gòu)的高信噪比成像，以及對線粒體黏度變化的成像;最后發(fā)展了一種小分子結(jié)構(gòu)的雙光子熒光染料，可作為探針設(shè)計平臺。這些探針可作為工具對細胞