調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺癌小鼠抑瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 肺癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康與生命。針對(duì)肺癌的致病特點(diǎn)，我們根據(jù)多年的臨床實(shí)踐，篩選有效藥物組方而成的調(diào)氣消積湯具有調(diào)暢氣機(jī)、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀的功效，在治療中重視升降理論的應(yīng)用，注重人體氣機(jī)運(yùn)動(dòng)的調(diào)暢，是臨床治療肺癌的有效方劑。本課題以中醫(yī)“氣機(jī)升降”理論為指導(dǎo)，以小鼠Lewis肺癌移植瘤型作為體內(nèi)試驗(yàn)研究對(duì)象，從生存質(zhì)量、腫瘤抑制率、免疫功能、移植瘤細(xì)胞凋亡以及血管生成等方面探討調(diào)

2、氣消積湯抗肺癌的作用及機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用調(diào)氣消積湯治療肺癌提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 將48只近交系C57BL/6小鼠常規(guī)接種Lewis肺癌，5天后選取荷瘤成功的小鼠隨機(jī)分四組：荷瘤對(duì)照組（MG）、調(diào)氣消積湯組（TG）、順鉑組（DG）、綜合組（調(diào)氣消積湯+順鉑組）（ZG），每組10只；健康的10只小鼠組成空白對(duì)照組（CG）。每天分別予飲用水、調(diào)氣消積湯各0.4ml灌胃12天；隔日一次腹腔注射生理鹽水、

3、順鉑0.13ml共3天。停藥后24小時(shí)取材。觀察各組小鼠日常生活狀況和腫瘤生長(zhǎng)情況，用H.E.染色法通過光鏡觀察腫瘤組織病理形態(tài)改變。觀察調(diào)氣消積湯對(duì)脾臟指數(shù)的影響，應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法計(jì)數(shù)小鼠外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，MTT比色法檢測(cè)小鼠脾T淋巴細(xì)胞的增殖情況，用Western Blot法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)。應(yīng)用電鏡技術(shù)與TUNEL法檢測(cè)調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，用Western Blot法檢測(cè)突

4、變型P53、Bcl-2基因蛋白的表達(dá)。應(yīng)用Western Blotting法檢測(cè)Lewis肺癌小鼠腫瘤組織的微血管密度（MVD）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.從體重、進(jìn)食量、小鼠的反應(yīng)性來看，調(diào)氣消積湯能改善Lewis肺癌小鼠一般狀況，五分鐘自主活動(dòng)及站立次數(shù)增加，與荷瘤對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與空白組比無明顯差異（P>0.05

5、）；其中順鉑組基本喪失站立能力，表現(xiàn)最差。
　　 2.光鏡下觀察，各實(shí)驗(yàn)組與荷瘤對(duì)照組比較，腫瘤細(xì)胞體積變小，異型細(xì)胞較少，細(xì)胞核致密，染色質(zhì)濃縮邊集，病理性核分裂較少；間質(zhì)可見較多的淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管內(nèi)腫瘤細(xì)胞少見，周圍壞死灶面積增大。
　　 3.調(diào)氣消積湯組、順鉑組和綜合組的瘤重均低于荷瘤對(duì)照組，差異顯著（P<0.01），三組的抑瘤率分別為29.37％、71.23％和75.19％，說明調(diào)氣消積湯具有抑制

6、腫瘤生長(zhǎng)的作用，與順鉑合用后抑瘤作用明顯增強(qiáng)。
　　 4.荷瘤對(duì)照組的脾臟指數(shù)明顯升高，是空白對(duì)照組的111.54％，差異顯著（P<0.01）；調(diào)氣消積湯可使荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)降低并趨向正常，與空白組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；順鉑組和綜合組的脾臟指數(shù)明顯降低，分別是空白對(duì)照組的36.55％和54.62％。
　　 5.從小鼠外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率及脾T淋巴細(xì)胞增殖活性來看，荷瘤對(duì)照組明顯低于空白對(duì)照組，且二者相比較

7、，差異顯著（P<0.01或P<0.05）；而調(diào)氣消積湯組比荷瘤對(duì)照組明顯升高，差異顯著（P<0.01），與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；順鉑組最低，與空白對(duì)照組及荷瘤對(duì)照組相比差異顯著（P<0.01）。說明提調(diào)氣消積湯能提高荷瘤小鼠的免疫功能。
　　 6.Western Blotting法結(jié)果顯示，順鉑組及綜合組均可升高Lewis肺癌移植瘤組織中TNF-α蛋白的表達(dá)，與荷瘤對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.01）

8、：而調(diào)氣消積湯組與荷瘤對(duì)照組比較無明顯差異（P>0.05）。
　　 7.電鏡下觀察，可見細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志--凋亡小體形成。
　　 8.TUNEL原位法檢測(cè)結(jié)果顯示，荷瘤對(duì)照組凋亡形態(tài)的細(xì)胞較少見，綠色熒光強(qiáng)度低；各治療組與荷瘤對(duì)照組相比凋亡細(xì)胞明顯增多，綠色熒光強(qiáng)度高；尤以綜合組增多最為明顯。說明調(diào)氣消積湯與順鉑合用可增強(qiáng)促肺癌細(xì)胞凋亡的能力。
　　 9.Western Blotting法結(jié)果顯示，調(diào)氣消積湯

9、組、順鉑組及綜合組均可降低突變型p53蛋白的表達(dá)，其灰度值與β-actin的比值分別為：（0.752±0.006）、（0.723±0.008）、（0.721±0.011），與荷瘤對(duì)照組（0.777±0.008）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中綜合組的突變型p53蛋白表達(dá)最低。各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白的表達(dá)情況與突變型p53相同。
　　 10.Western Blotting法結(jié)果表明，各治療組的MVD、VEGF和MMP-9蛋白的表達(dá)均

10、低于荷瘤對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；調(diào)氣消積湯組MVD、VEGF和MMP-9蛋白的表達(dá)與順鉑組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1.調(diào)氣消積湯可以改善荷瘤小鼠的一般生活狀況，對(duì)Lewis肺癌有抑制作用，與化療合用后抑瘤效果明顯增強(qiáng)。
　　 2.調(diào)氣消積湯對(duì)Lewis肺癌小鼠的免疫器官（脾）有一定的保護(hù)作用；可以通過提高荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、脾T淋

11、巴細(xì)胞增殖活性，來增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能；對(duì)腫瘤組織中TNF-α蛋白的表達(dá)無明顯促進(jìn)和抑制作用。
　　 3.調(diào)氣消積湯能促進(jìn)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡，與化療藥物合用能增強(qiáng)促肺癌細(xì)胞凋亡的能力；下調(diào)凋亡相關(guān)基因突變型p53、Bcl-2的表達(dá)水平，可能是調(diào)氣消積湯發(fā)揮抑瘤作用的分子機(jī)制之一。
　　 4.調(diào)氣消積湯能降低Lewis肺癌移植瘤的微血管密度（MVD）；并通過下調(diào)移植瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及基質(zhì)金屬蛋