腺病毒介導的內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈驦ewis肺癌的抑制及其與化療協(xié)同作用的實驗研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文腺病毒介導的內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈驦ewis肺癌的抑制及其與化療協(xié)同作用的實驗研究姓名：馬凌云申請學位級別：博士專業(yè)：內(nèi)科學（呼吸系病）指導教師：劉忠令20040301，=軍醫(yī)夫掌博士掌t論文腺病毒介導的內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈驦ewis肺癌的抑制及其與化療協(xié)同作用的實驗研究中文摘要血管抑制療法是目前腫瘤治療研究的一個熱點。1997年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮抑素因其抑制血管生成作用強而備受關(guān)注，內(nèi)皮抑素重組蛋白在動物實驗及臨床試驗中已顯

2、示出明顯的抑瘤作用。但內(nèi)皮抑素蛋白制劑存在時效短、需反復追加，并且可引起全身性副作用等不足，使其在臨床的應用受到限制。為解決這一矛盾，本實驗構(gòu)建攜帶小鼠內(nèi)皮抑素(mouSeEndostatin，mES)基因的復制缺陷型腺病毒載體(AdmES)，在體外證明其轉(zhuǎn)染效率、安全性及其血管抑制活性的基礎上，研究AdruES對小鼠Le硒s肺癌生長、轉(zhuǎn)移的抑制及其與化療的協(xié)同作用。目前國內(nèi)尚無文獻報道，本實驗從以下三部分進行研究：第一部分攜帶內(nèi)皮抑素

3、基因的增殖缺陷型重組腺病毒載體(AdmES)的構(gòu)建及其制備目的構(gòu)建攜帶小鼠內(nèi)皮抑素基因的復制缺陷型腺病毒載體(AdmES)，并進行體外安全性檢測。方法選擇mES基因為治療基因，以腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移工具，將其亞克隆至穿梭質(zhì)粒中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCAl3ruES，再通過陽離子脂質(zhì)體法，與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒pBGHE3共轉(zhuǎn)染293細胞，在293細胞內(nèi)進行兩質(zhì)粒同源重組，構(gòu)建成具有感染活力的復制缺陷型腺病毒AdmES。將酶切鑒定正確的病毒在29

4、3細胞內(nèi)進一步擴增，通過氯化銫密度梯度離心法純化和50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)進行滴度測定，并通過感染Hela細胞對其安全性進行評價。結(jié)果成功將mES基因插入腺病毒載體，擴增純化后的重組腺病毒滴度高達10mpfu／ml；將該載體轉(zhuǎn)染Heta(宮頸癌)細胞后，觀察7天，細胞的形態(tài)及增殖均表現(xiàn)正常，未見細胞病理效應(CPE)。結(jié)論我們所制備的重組腺病毒AdmES滴度高、純度好、毒性低。第二部分AdruES體外轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺