腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈驦ewis肺癌的抑制及其與化療協(xié)同作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈驦ewis肺癌的抑制及其與化療協(xié)同作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：馬凌云申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（呼吸系?。┲笇?dǎo)教師：劉忠令20040301，=軍醫(yī)夫掌博士掌t論文腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素基因?qū)π∈驦ewis肺癌的抑制及其與化療協(xié)同作用的實(shí)驗(yàn)研究中文摘要血管抑制療法是目前腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。1997年發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮抑素因其抑制血管生成作用強(qiáng)而備受關(guān)注，內(nèi)皮抑素重組蛋白在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中已顯

2、示出明顯的抑瘤作用。但內(nèi)皮抑素蛋白制劑存在時(shí)效短、需反復(fù)追加，并且可引起全身性副作用等不足，使其在臨床的應(yīng)用受到限制。為解決這一矛盾，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建攜帶小鼠內(nèi)皮抑素(mouSeEndostatin，mES)基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體(AdmES)，在體外證明其轉(zhuǎn)染效率、安全性及其血管抑制活性的基礎(chǔ)上，研究AdruES對(duì)小鼠Le硒s肺癌生長、轉(zhuǎn)移的抑制及其與化療的協(xié)同作用。目前國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)從以下三部分進(jìn)行研究：第一部分?jǐn)y帶內(nèi)皮抑素

3、基因的增殖缺陷型重組腺病毒載體(AdmES)的構(gòu)建及其制備目的構(gòu)建攜帶小鼠內(nèi)皮抑素基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體(AdmES)，并進(jìn)行體外安全性檢測(cè)。方法選擇mES基因?yàn)橹委熁?，以腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移工具，將其亞克隆至穿梭質(zhì)粒中構(gòu)建成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCAl3ruES，再通過陽離子脂質(zhì)體法，與腺病毒基因組骨架質(zhì)粒pBGHE3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行兩質(zhì)粒同源重組，構(gòu)建成具有感染活力的復(fù)制缺陷型腺病毒AdmES。將酶切鑒定正確的病毒在29

4、3細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)增，通過氯化銫密度梯度離心法純化和50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)進(jìn)行滴度測(cè)定，并通過感染Hela細(xì)胞對(duì)其安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果成功將mES基因插入腺病毒載體，擴(kuò)增純化后的重組腺病毒滴度高達(dá)10mpfu／ml；將該載體轉(zhuǎn)染Heta(宮頸癌)細(xì)胞后，觀察7天，細(xì)胞的形態(tài)及增殖均表現(xiàn)正常，未見細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)。結(jié)論我們所制備的重組腺病毒AdmES滴度高、純度好、毒性低。第二部分AdruES體外轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺