腺病毒介導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮抑素對(duì)荷骨肉瘤裸鼠肺轉(zhuǎn)移抑制的研究.pdf

1、目的:通過自行構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的小鼠內(nèi)皮抑素并觀察其在體內(nèi)、外的表達(dá)及對(duì)腫瘤血管和荷骨肉瘤裸鼠肺轉(zhuǎn)移的抑制作用,探討內(nèi)皮抑素表達(dá)水平與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 方法:1、以mEndostatin質(zhì)粒為模板通過PCR方法擴(kuò)增回收mEndostatin基因,將mEndostatin基因連接到腺病毒載體PDC315中,構(gòu)建PDC315-mEndo表達(dá)質(zhì)粒。將此表達(dá)質(zhì)粒與腺病毒重組質(zhì)粒pBGHE3通過lipofecetamine2000

2、共同轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,經(jīng)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒Ad-mEndo,用氯化銫密度梯度超速離心法純化,用50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。體外轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株MG-63,用western印跡檢測感染的骨肉瘤細(xì)胞上清液mEndostatin的表達(dá)并通過雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)(CAM)觀察其抑制血管形成的活性。2、建立荷骨肉瘤裸鼠動(dòng)物模型:采用骨肉瘤細(xì)胞系MG-63,0.2ml細(xì)胞懸液(約1x106個(gè)細(xì)胞)/只注射到30只裸鼠右前肢皮下,一周后全部

3、成瘤,隨機(jī)分為3組:Ad-mEndo組(10只),Ad-EGFP組(10只),PBS組(10只)。另外以未接種腫瘤細(xì)胞的裸鼠(10只)作空白對(duì)照組。然后各組每周分別注射相應(yīng)藥物200ul/次,連續(xù)五次,最后抽血用免疫酶聯(lián)吸附反應(yīng)(ELISA)檢測其內(nèi)皮抑素表達(dá)水平;并用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑計(jì)算腫瘤體積,并于七周后處死觀察有無肺轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)果：1、擴(kuò)增得到的mEndostatin經(jīng)酶切鑒定、PCR擴(kuò)增、DNA測序證實(shí)為

4、鼠源性內(nèi)皮抑素,重組腺病毒Ad-mEndo的滴度為2.5×1010pfu/ml,體外能高效轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞株,可分泌表達(dá)有抑制血管形成活性的mEndostatin。2、治療結(jié)束后Ad-mEndo組腫瘤體積明顯小于Ad-EGFP組和PBS組而其內(nèi)皮抑素表達(dá)水平明顯高于Ad-EGFP組和PBS組,并有顯著性差異(P＜0.05)。同時(shí)觀察三組裸鼠的肺臟發(fā)現(xiàn)Ad-mEndo組肺部未發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶,而其他兩組裸鼠肺部可見大量散在轉(zhuǎn)移灶,肺轉(zhuǎn)移率＞7